0 조회수 • 2:52 분 • July 8th, 2025
대동맥 판막 전단지에는 세포외 기질층 전체에 분포된 판막 간질 세포(VIC)의 이질적인 집단이 포함되어 있습니다. 자극을 받으면 VIC는 뼈 기질 형성 세포인 조골세포로 변형됩니다.
성숙한 조골세포는 콜라겐과 골기질 단백질을 분비합니다. 이 단백질은 조골세포가 기질에 부착되도록 돕습니다. 마지막으로 세포내 칼슘 이온은 기질 환경으로 들어가 인산염과 함께 광물화된 결절로 침착되어 대동맥 판막 석회화를 유발합니다.
석회화된 대동맥 판막의 칼슘 농도를 평가하려면 6웰 플레이트에서 VIC 배양으로 시작합니다. 배양 배지를 버리고 골형성 배지를 웰에 넣고 배양합니다.
배양하는 동안 골형성 배지의 인슐린은 VIC를 자극하여 골형성 표현형으로 분화합니다. 이 조골세포는 골형성 배지에서 골기질 단백질과 아스코르브산을 분비하여 콜라겐이 풍부한 세포외 기질을 형성하도록 유도합니다.
마지막으로, 조골세포의 세포내 칼슘과 배지의 인산염은 배지에서 광물화된 결정을 형성합니다.
배지를 제거하고 염산 용액을 추가합니다. 칼슘 이온을 용액에 가용화하기 위해 배양합니다. 칼슘을 함유한 산성 배지를 멀티웰 플레이트의 웰에 분배합니다.
칼슘에 민감한 염료를 첨가하고 배양합니다. 염료 분자는 산성 매질의 칼슘 이온에 결합하여 보라색 염료-칼슘 복합체를 형성합니다.
샘플의 칼슘 농도에 비례하는 복합체의 흡광도를 측정합니다.
분석을 시작하기 전에 생물학적 안전 후드를 70% 에탄올로 청소하고 DMEM 배지를 섭씨 37도로 따뜻하게 합니다. 다음으로, 조건당 100,000개의 세포를 완전한 DMEM의 6웰 플레이트에 시드하고 섭씨 37도에서 배양합니다.
24시간 후 상청액 배지를 석회화 배지로 교체하고 세포를 섭씨 37도에서 7일 동안 배양하고 3일째에 배지를 교체합니다.
7일 후, Arsenazo III 시약을 사용하여 96웰 플레이트에서 칼슘 농도를 측정하고 650나노미터에서 흡광도를 기록합니다.