0 조회수 • 4:57 분 • July 8th, 2025
제브라피쉬의 경우 대기 오염 물질인 주변 미세먼지(PM)가 산화 스트레스로 인한 심장 기능 장애를 유발합니다.
PM이 제브라피쉬에 미치는 영향을 연구하려면 먼저 제브라피쉬 배아를 PM 유래 추출 가능한 유기물(EOM)에 노출시켜 활성 산소종(ROS) 생성을 유발합니다.
ROS는 DNA 염기 구아닌을 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신 또는 8-OHdG로 산화시키고 히스톤 H2AX의 인산화를 일으켜 DNA 이중 가닥 절단의 마커인 γH2AX를 형성합니다.
노출 후 제브라피쉬 심장을 해부하여 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 단백질을 가교하여 세포 구조를 안정화시키는 고정액으로 심장을 치료합니다.
다음으로, 비특이적 결합 부위를 방지하기 위해 차단 시약을 추가합니다. 심장 세포에서 γH2AX 및 8-OHdG를 표적으로 하는 1차 항체를 추가합니다.
다음으로, 각각의 1차 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 두 개의 서로 다른 색상의 형광 표지 2차 항체를 추가합니다. 마지막으로, DNA에서 AT가 풍부한 서열의 작은 홈에 결합하여 형광 복합체를 형성하는 DNA 특이적 염색제인 DAPI로 표본을 염색합니다.
슬라이드를 형광 현미경 아래에 놓아 EOM 처리된 제브라피쉬 배아의 심장에서 8-OHdG 및 γH2AX 발현의 신호를 관찰합니다.
심장 세포에서 상당히 높은 형광 강도는 EOM에 의해 유도된 산화 DNA 손상 및 이중 가닥 절단을 나타냅니다.
소수성 배리어 펜을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 원을 그립니다. 50마이크로리터의 4% 파라포름알데히드를 1.25마이크로리터의 PBS에 첨가하여 고정액을 만듭니다. 그런 다음 해부된 심장 3개를 하나의 소수성 장벽 원에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
현미경으로 용액을 디캔팅하고 샘플을 실온에서 최소 5분 동안 건조시킵니다. 슬라이드를 PBST에서 세척당 5분 동안 세 번 세척합니다. 50마이크로리터의 BSA를 1,000마이크로리터의 PBST에 첨가하여 5% BSA 용액을 얻고, 슬라이드를 습한 챔버에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 항체 결합을 차단합니다.
용액을 디캔팅하고 세척당 5분 동안 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다. 8-하이드록시-데옥시구아노신에 대한 마우스 단클론 항체 2마이크로리터와 감마-H2AX에 대한 토끼 다클론 항체 2마이크로리터를 296마이크로리터의 PBST에 희석하여 작동하는 1차 항체 칵테일 용액을 얻습니다.
심장 샘플을 50마이크로리터의 1차 항체 칵테일 용액과 함께 가습 챔버에서 실온에서 최소 1시간 또는 섭씨 4도에서 밤
새 배양합니다.용액을 디캔팅하고 세척당 5분 동안 PBST로 샘플을 세 번 세척합니다. FITC 표지 염소 항 마우스 2차 항체 1마이크로리터와 cy3 염소 항토끼 2차 항체 1마이크로리터를 PBST 500마이크로리터에 희석하여 작동하는 2차 항체 칵테일 용액을 얻습니다.
샘플을 2차 항체와 함께 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
용액을 디캔팅하고 세척당 5분 동안 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다. 핵 염색을 위해 샘플에 20마이크로리터의 DAPI를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 슬라이드에 커버슬립을 바르고 매니큐어로 밀봉하여 건조와 움직임을 방지합니다.
형광 현미경으로 샘플을 이미지화하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 심장 부위의 형광 신호를 정량화합니다. DMSO 대조군 표본의 평균을 사용하여 상대적 변화를 계산하고 데이터의 통계적 유의성을 결정합니다.