생체 외 간질 모델에서 세포 사멸을 평가하기 위한 신경 세포 사멸 분석

뇌의 자발적이고 반복적인 발작인 간질은 신경 세포 사멸로 이어집니다.

생체 외 간질 모델에서 신경 세포 사멸을 연구하려면 먼저 쥐 새끼 뇌에서 준비된 비피질-해마 기관형 절편을 적절한 배지에서 채취합니다.

기관형 절편은 코 피질과 해마로 구성됩니다. 점진적인 혈청 결핍 상태에서 이러한 영역은 발작으로 인한 신경 사멸로 이어지는 진화하는 간질 사건을 나타냅니다.

필요한 양의 요오드화 프로피듐(PI)(형광 염료)을 배양액에 첨가하고 배양합니다. 손상된 세포막을 통해 PI는 죽은 뉴런에 들어가 DNA에 결합합니다. 온전한 막을 가진 살아있는 뉴런은 PI 흡수가 가능하지 않습니다.

면역염색을 위해 기관형 슬라이스를 현미경 슬라이드에 놓습니다. 투과화 차단 용액을 첨가하고 배양합니다.

용액의 세제 분자는 막 지질을 용해시켜 온전한 세포의 막에 기공을 생성하여 후속 면역염색 단계를 위해 투과성을 제공합니다. 차단 용액의 단백질은 세포의 비특이적 부위에 수동적으로 결합하여 배경 염색을 줄입니다.

뉴런 내부에 침투하여 핵 기질에 분포된 뉴런 특이적 핵 항원(NeuN)에 결합하는 1차 항체 용액을 추가합니다. 1차 항체에 결합하는 형광 표지 2차 항체를 추가합니다.

슬라이드에 장착 매체를 놓아 시편을 안정화하고 커버슬립으로 밀봉합니다. 공초점 현미경에서 이중 염색을 보이는 세포(PI 양성인 NeuN 염색 뉴런)는 뉴런 사멸을 나타냅니다.

요오드화 프로피듐 흡수 분석을 수행하려면 생물 안전 캐비닛에서 작업하십시오.

웰에서 인서트를 들어 올리고 중간에 요오드화 프로피듐을 웰당 2마이크로몰의 최종 농도까지 첨가합니다. 인서트를 웰에 다시 넣기 전에 플레이트를 천천히 저어주고 슬라이스 아래에 기포가 없는지 주의하십시오. 모든 슬라이스가 처리되면 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.

슬라이스의 면역염색을 위해, 요오드화 프로피듐 배양이 끝날 때, 각 웰의 바닥에서 배지를 흡인하고, 각 삽입물의 상단과 하단에 4% 파라포름알데히드 1밀리리터를 첨가한다.

실온에서 1시간 후, 슬라이스를 10분 동안 2회 세척하고 세척당 PBS 1밀리리터를 세척하고 소수성 펜을 사용하여 현미경 슬라이드에 두 개의 직사각형을 그립니다.

날카로운 칼날을 사용하여 인서트에서 슬라이스를 자르고 각 직사각형에 한 조각을 놓습니다. 실온에서 3시간 동안 배양하기 위해 각 슬라이스에 투과화/차단 용액을 첨가합니다. 배양이 끝나면 밤새 섭씨 4도 배양을 위해 각