0 조회수 • 4:04 분 • July 8th, 2025
아미노산 수송체는 세포막을 가로지르는 아미노산 전달을 매개하여 중요한 세포 과정을 조절하는 막 결합 단백질입니다.
시험관 내에서 아미노산 흡수를 연구하려면 마우스 골수 유래 간질 세포를 배양합니다. 성장 배지를 흡인합니다. 방사성 수소로 표지된 아미노산인 글루타민이 보충된 예열된 완충액을 추가합니다. 필요한 시간 동안 배양합니다.
예열된 완충액은 글루타민의 세포 흡수에 필요한 생리학적 온도와 적절한 pH를 제공합니다. 글루타민 수송체는 나트륨 이온 결합 공수송을 통한 기질 전좌를 담당하는 수송 도메인과 막 고정 스캐폴드 도메인으로 구성됩니다.
수송 도메인은 완충액의 나트륨 이온과 함께 방사성 표지된 글루타민에 결합합니다. 결합하면 분자를 세포질로 방출합니다. 동시에, 수송 도메인은 세포 내 나트륨 이온과 중성 아미노산을 세포 외부로 이동시켜 세포 항상성을 초래합니다.
얼음처럼 차가운 완충액으로 세포를 세척하여 반응을 종료하고 세포외 방사성 표지 글루타민을 제거합니다. 세제 용액을 추가합니다. 세제는 세포를 용해시켜 세포 내 방사성 표지 글루타민을 방출합니다.
용해물을 원심분리합니다. 글루타민 함유 상청액을 섬광 칵테일이 담긴 바이알에 넣고 바이알을 섬광 카운터 안에 넣습니다.
방사성 표지된 글루타민 분자는 고에너지 베타 입자를 방출합니다. 칵테일의 신틸레이터는 입자를 흡수하고 섬광 카운터에 의해 감지되는 빛 펄스를 방출합니다.
방사능을 측정하여 세포 글루타민 흡수를 추정합니다.
아미노산 흡수 분석을 시작하려면 FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 알파-MEM 배지에서 12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 5 x 104 ST2 세포를 플레이트합니다. 정규화를 위한 조건별로 세포 수를 정량화하기 위해 세포의 여분의 웰을 플레이트합니다.
다음으로, 합류할 때까지 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 2-3일 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, 배지를 흡인하고 pH 7.4에서 PBS 1밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 한 번 세척하기 전에 1밀리리터 크렙스 링거 HEPES 또는 KRH로 PBS를 흡인합니다.
밀리리터당 4개의 마이크로큐리 L-[3,4-3H]-글루타민 작업 배지를 함유한 0.5밀리리터의 새로 준비된 KRH와 함께 세포를 5분 동안 배양합니다. 배양 후 방사성 매체를 수집하여 액체 폐기물 용기에 분배합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 KRH로 세포를 세 번 세척하여 반응을 종료합니다.
다음으로, 각 웰에 1% 도데실 황산나트륨 1밀리리터를 첨가하고 혼합물을 10회 분쇄하여 세포를 용해하고 균질화합니다. 그런 다음 세포 용해물을 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 최소 속도 10,000g으로 10분 동안 원 심분리하여 용해물을 정화합니다.
상청액을 8밀리리터의 섬광 용액이 들어 있는 섬광 바이알로 옮기고 섬광 카운터를 사용하여 분당 방사능을 읽습니다.
세포의 나머지 비방사성 플레이트에서 세포를 트립신화, 재현탁 및 계수하여 용해된 방사성 배양의 세포 수를 추정합니다. 혈구계를 사용하여 각 실험 조건에 대해 비방사성 웰당 세포 수를 계산합니다.