타겟 검증에서 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase) 의존성이 중요한 이유는 무엇입니까?

본 분석법은 외생 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase)를 이용하여 젖산을 피루브산으로 전환함으로써, 용해물 내의 내생 효소에 의해 신호 생성이 방해받지 않도록 합니다. 이러한 의존성을 통해 비색 신호를 젖산 농도에 구체적으로 귀속시킬 수 있으며, 이는 대사 경로에서 정확한 표적 검증을 가능하게 합니다.

젖산을 독립 변수로 분리하는 것이 발견 파이프라인에 어떻게 부합합니까?

실험 조건에 따른 젖산 수치를 정량화함으로써, 본 분석법은 젖산을 당분해 Flux의 측정 가능한 결과물로 분리하여 연구자가 유전적 또는 약물학적 섭동을 에너지 대사 변화와 연결 지을 수 있게 합니다. 이는 경로 활성의 위험 부담이 적은 정량적 바이오마커를 제공함으로써 조기 발견을 지원합니다.

570 nm에서의 정량적 흡광도 측정으로 무엇을 할 수 있습니까?

배경 값을 뺀 570 nm에서의 흡광도 측정값을 사용하여 기지의 젖산 농도로 표준 곡선을 생성하며, 이를 통해 시험 샘플의 젖산 수준을 보간할 수 있습니다. 이러한 정량적 결과물은 스크리닝 캠페인에서 용량-반응 분석 및 실험군 간의 비교를 가능하게 합니다.

교차 기능 협업에서 중복 분석 요구사항이 중요한 이유는 무엇입니까?

각 샘플에 대해 중복 측정을 수행하면 데이터 신뢰도가 높아지고 기술적 편차가 줄어들며, 이는 생물학, 스크리닝 및 분석 팀 간의 일관된 해석을 위해 필수적입니다. 이러한 관행은 발견 단계와 전임상 단위 간의 재현 가능한 인수인계를 지원합니다.

구현 전 어떤 통계 분석 능력이 요구됩니까?

팀은 검정 곡선을 생성하고, 선형 회귀 분석을 수행하며, 곡선을 통해 미지 농도를 보간한 후, 희석 배수 보정(예: 프로토콜에 기재된 대로 2.25를 곱함)을 수행할 수 있어야 합니다. 이러한 역량을 통해 흡광도 원시 데이터로부터 정확한 젖산 정량이 가능해집니다.

테스트 샘플에서 젖산의 정량화를 위한 비색 분석

JoVE Encyclopedia of Experiments

생물학적 기술

0 조회수 • 3:08 분 • July 8th, 2025

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살아있는 세포에서 혐기성 조건에서 효소 젖산 탈수소효소는 해당작용의 최종 산물인 피루브산을 주요 대사 산물인 젖산으로 전환합니다. 세포에서 생성되는 젖산의 양은 세포의 대사 상태를 반영합니다.

세포내 젖산 농도를 정량화하려면 단백질이 없는 선충 세포 용해물의 테스트 샘플로 시작합니다. 멀티웰 플레이트의 다른 웰을 다양한 알려진 농도의 젖산 용액으로 보충합니다.

용해물에는 내인성 젖산 탈수소효소를 포함한 모든 단백질 효소가 부족하여 정확한 젖산 정량화가 보장됩니다.

최적의 효소 활성을 위해 적절한 pH를 유지하기 위해 각 웰에 젖산 분석 완충액을 추가합니다. 젖산 탈수소효소 효소, 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 조효소, 비색 프로브를 포함하는 반응 혼합물로 웰을 보충하고 배양합니다.

배양하는 동안 젖산 탈수소효소는 세포 젖산의 피루브산으로의 산화를 촉매하고 동시에 NAD를 NADH로 환원시킵니다. 생성된 NADH는 비색 프로브와 반응하여 보라색 생성물을 생성합니다.

570나노미터에서 테스트 샘플 및 젖산 표준물질에 대한 보라색 용액의 흡광도를 분광학으로 측정합니다. 젖산 표준물질의 흡광도 값을 플로팅하고 검량선을 생성합니다.

마지막으로, 샘플의 흡광도 값을 젖산 표준과 비교하여 테스트 샘플에 존재하는 젖산의 양을 결정합니다.

젖산 농도를 측정하려면 비색 분석 키트를 사용하여 테스트 샘플에 대한 중복 분석을 수행합니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터의 테스트 샘플을 추가한 다음 각 샘플에 젖산 분석 완충액을 추가하여 부피를 50마이크로리터로 조정합니다.

젖산 분석 완충액으로 100밀리몰 L(+)-젖산 표준물질을 1밀리몰로 희석합니다. 그런 다음 일련의 웰에 0, 2, 4, 6, 8 및 10마이크로리터의 희석된 L(+)-젖산 표준물질을 첨가합니다. 각 웰에 50마이크로리터의 반응 혼합물을 넣고 색상이 발현할 때까지 빛으로부터 보호된 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다.

마지막으로 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 반응 혼합물의 흡광도에서 배경 제어 혼합물의 흡광도를 뺍니다. 그런 다음 젖산 표준 곡선을 표시하고 각 농도에 2.25를 곱하여 곡선에서 젖산 농도를 계산합니다.