글리코겐 합성효소 활성을 결정하기 위한 분광광도계 분석

글리코겐 합성에 중요한 효소인 글리코겐 합성효소는 우리딘 이인산 포도당 또는 뉴클레오티드 당인 UDP-포도당을 UDP와 글리코실 잔기로 절단하고 방출된 포도당 단량체를 성장하는 글리코겐 사슬에 추가합니다.

글리코겐 합성효소 활성을 추정하려면 먼저 글리코겐, UDP-포도당, ATP, 포스포에놀피루베이트 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)를 포함하는 반응 혼합물을 튜브에 담아 복용합니다. 뉴클레오사이드 이인산염 또는 NDP, 키나아제 효소, 피루브산 키나아제 및 젖산 탈수소효소 효소 칵테일을 첨가합니다. 내용물을 혼합하고 배양합니다.

글리코겐 합성효소 함유 샘플을 튜브에 추가하여 효소 반응을 시작합니다.

글리코겐 합성효소는 UDP-포도당에 작용하여 UDP와 글리코실 잔기를 생성합니다. 효소는 유리 포도당 단량체를 흡수하여 반응 혼합물의 글리코겐 사슬에 통합합니다. ATP가 있는 상태에서 반응 혼합물의 NDP 키나아제는 사용하지 않은 UDP를 인산화하여 UTP로 변환하고 ADP를 생성합니다.

효소 피루브산 키나아제는 ADP에 작용하여 반응 혼합물의 인산에놀피루브산에 의해 기증된 인산염을 첨가하여 ATP와 피루브산을 생성합니다. 다음으로, 젖산 탈수소효소는 피루브산을 젖산으로 전환하고 반응 중에 NADH를 산화시킵니다.

340nm에서 NADH 흡광도의 감소를 측정하여 소비된 NADH의 양을 정량화하며, 이는 성공적인 효소 활성을 나타냅니다.

글리코겐 합성효소 활성의 결정부터 시작하려면, 이전에 준비된 UDP-포도당, ATP, 포스포에놀피루베이트 및 NDP 키나아제의 원액을 얼음 위에서 해동합니다. 수조를 섭씨 30도로 예열하십시오.

원액이 준비되면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시약을 15밀리리터 튜브에 추가하여 글리코겐 합성효소 분석의 수에 따라 충분한 분석 혼합물을 준비합니다.

반응 혼합물의 NADH를 물로 대체하여 블랭크 반응을 준비하고 반응을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다. 블랭크 반응을 사용하여 분광 광도계의 'Zero'를 340나노미터의 파장으로 설정합니다.

1.5밀리리터 튜브에 반응 혼합물의 770마이크로리터 분취량 1개를 취하고 NDP 키나아제와 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소 혼합물을 각각 2마이크로리터씩 튜브에 순차적으로 첨가합니다.

드럽게 혼합한 후 튜브를 수조에서 섭씨 30도에서 3분 동안 배양하여 반응 혼합물을 예열합니다. 그런 다음 글리코겐 합성효소를 함유한 샘플 30마이크로리터를 pH 7.8의 20밀리몰 트리스 완충액에 넣고 부드럽게 혼합한 후 반응 혼합물을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다.

큐벳을 분광 광도계에 넣고 10-20분 동안 시간 간격으로 340나노미터에서 흡광도를 기록합니다. 그런 다음 시간에 대해 얻은 흡광도를 플로팅합니다.