인플루엔자 바이러스 감염의 다양성을 측정하기 위한 임피던스 기반 세포 분석

인플루엔자 바이러스 감염 중에 바이러스는 엔도사이토시스를 통해 세포에 들어가 숙주 세포 기계를 탈취하여 자손 비리온을 생성합니다. 이것들은 방출되어 인접 세포를 감염시켜 일련의 감염을 일으킵니다.

배양 중 감염성 인플루엔자 바이러스 대 세포 비율(감염 다양성)을 측정하려면 새로 얻은 포유류 세포 현탁액의 적절한 밀도를 마이크로타이터 플레이트에 추가합니다.

플레이트에는 웰 바닥에 내장된 임피던스 측정 금 미세 전극이 포함되어 있습니다. 배양하여 세포가 우물 바닥에 부착되고 감염 전에 기하급수적인 성장 단계에 도달할 수 있도록 합니다.

미세 전극 사이에 작은 전위를 가합니다. 미세 전극에 부착된 셀은 절연체 역할을 하여 전류 흐름을 제한하고 측정되는 전기 저항(임피던스)을 증가시킵니다.

미디어를 제거합니다. 인플루엔자 바이러스 현탁액을 우물에 피펫팅합니다. 적절한 세린 엔도프로테아제를 보충하십시오.

배양하는 동안 세린 엔도프로테아제는 바이러스 당단백질 헤마글루티닌을 절단하고 활성화하여 특정 숙주 세포 수용체에 대한 결합 및 후속 바이러스 세포 진입을 촉진합니다.

숙주 세포 기계를 사용하여 새로운 바이러스 입자가 생성되고 방출되어 인접 세포를 감염시킵니다. 결과적으로 바이러스에 감염된 세포는 형태학적 변화를 겪고 세포병증 효과를 나타내어 세포가 미세 전극 표면에서 분리되어 시간이 지남에 따라 임피던스가 감소하는 세포 사멸로 이어집니다.

바이러스가 추가되기 전에 임피던스가 초기 임피던스의 절반으로 감소하는 데 걸리는 시간을 결정합니다. 더 짧은 시간 프레임은 바이러스 감염의 다양성이 더 높다는 것을 시사합니다.

CIT₅₀ 값과 감염 다중성 사이의 상관관계를 결정하기 위해, 3 x 10⁴ 새로 분할된 MDCK 세포를 전자 마이크로타이터 플레이트의 각 벽에 24시간 동안 배양한 후, 세척당 웰당 100마이크로리터의 신선한 바이러스 증식 배지로 세포를 2회 세척하고, 단일 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100마이크로리터의 바이러스 현탁액을 추가합니다.

모든 바이러스 희석액이 추가되면 실시된 대로 35°C에서 기기의 크래들 포켓에 플레이트를 부드럽게 로드하고 시연된 대로 최소 100시간 동안 15분마다 세포 임피던스를 모니터링하기 시작합니다.

두 주기의 측정 후 장치를 클릭하여 "일시 중지"하고 크래들에서 E-플레이트를 제거합니다. TPCK-트립신이 보충된 100마이크로리터의 바이러스 증식 배지를 각 웰에 추가하고 E-플레이트 플레이트를 크래들 포켓으로 되돌립니다. 그런 다음 분석을 시작합니다.