0 조회수 • 3:35 분 • July 8th, 2025
세포는 대사 과정에서 낮은 수준의 자유 라디칼을 생성합니다.
병리학적 상태에서는 자유 라디칼 과잉 생산이 발생하여 산화 스트레스를 유발합니다. 이 자유 라디칼은 지질 과산화라는 과정에서 세포막 인지질의 고도불포화 지방산을 공격합니다. 이것은 지질 하이드로퍼옥사이드 및 말론디알데히드(MDA)를 포함한 독성 산화 생성물을 형성하여 막 손상과 세포 사멸을 유발합니다.
티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석을 사용하여 시험관 내에서 인간 혈청의 산화 스트레스를 검출하려면 산화 유도 화합물로 처리된 인간 혈청이 들어 있는 튜브로 시작합니다. 처리된 혈청은 주로 인지질, 지질 및 단백질과 함께 지질 과산화 산물(MDA 및 지질 하이드로퍼옥사이드)으로 구성됩니다.
다음으로, 도데실황산나트륨(SDS)을 첨가하고 혼합하여 지질을 가용화하고 MDA를 방출합니다. SDS는 오염 단백질을 변성시킵니다. 적절한 산성 완충액을 첨가한 다음 산성 티오바르비투르산(TBA)을 첨가합니다. 고온에서 배양하십시오.
산성 조건과 고온에서 TBA 분자는 MDA와 반응하여 TBARS라고 하는 안정적인 적분홍색 MDA-TBA 복합체를 형성합니다. 얼음 위에서 배양하여 반응을 멈추고 기존 복합체를 안정화시킵니다.
원심 분리기. MDA-TBA 함유 상청액을 수집하여 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 복합체의 흡광도를 측정합니다.
흡광도가 높을수록 TBARS 농도가 높다는 것을 의미하며, 이는 혈청 내 지질 과산화 산물과 산화 스트레스 수준이 높다는 것을 나타냅니다.
분석할 샘플의 유리관에 라벨을 붙인 다음 준비된 샘플 100마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다. 각 샘플에 200마이크로리터의 8.1% SDS를 추가하고 유리관을 원을 그리며 부드럽게 소용돌이쳐 혼합합니다.
각 샘플에 1.5밀리리터의 3.5몰 아세테이트나트륨 완충액을 첨가합니다. 그런 다음 0.8% 티오바르비투르산 수용액 1.5밀리리터를 첨가합니다. 700마이크로리터의 탈이온수를 추가하여 각 튜브의 최종 부피를 4밀리리터로 만듭니다. 유리관을 단단히 덮고 섭씨 95도로 설정된 가열 블록에서 1시간 동안 배양합니다. 결로를 방지하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 그런 다음 블록에서 튜브를 제거하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
배양 후, 샘플과 표준물질을 섭씨 4도에서 10분 동안 1,500 x g으로 원심분리합니다. 각 튜브에서 150마이크로리터의 상청액을 96웰 플레이트의 웰로 옮기고 피펫 팁으로 기포를 제거합니다.
532나노미터에서 샘플의 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 다른 모든 흡광도 판독값에서 빈 샘플의 평균 흡광도 판독값을 뺍니다.
표준 곡선을 생성하고 이를 사용하여 알 수 없는 샘플 농도를 계산합니다.