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포유류의 눈에서 공막과 망막 사이에 위치한 맥락막에는 혈관주위 대식세포와 맥락모세혈관(망막에 산소와 영양분을 공급하는 주위 세포로 늘어선 모세혈관 층)이 포함되어 있습니다. 맥락모세혈관에서 비정상적인 혈관이 돋아나는 것은 여러 혈관성 안구 질환에서 발생합니다.
생체 외에서 발아하는 조절 장애 맥락모세혈관을 연구하기 위해 공막과 망막 색소 상피 또는 RPE에 부착된 맥락막을 포함하는 수확된 마우스 눈 외식편을 채취합니다.
기저막 추출물 또는 BME(세포외 기질 단백질이 풍부한 하이드로겔)의 방울을 멀티웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 조직이 평평해지지 않도록 외식편을 물방울에 놓습니다. BME가 응고되도록 합니다.
내피 세포 또는 EC 특이적 성장 인자가 보충된 배지를 추가합니다. 인큐베이트. RPE는 혈관 내피 성장 인자를 분비하는데, 이는 EC 특이적 성장 인자와 함께 모세혈관 EC 증식을 자극합니다.
응고된 BME는 증식하는 EC를 촉진하여 발아하는 모세혈관과 같은 세뇨관을 형성하는 세포외 기질을 형성합니다. 주위 세포는 이러한 발아 모세혈관에 이동하여 부착되어 모세혈관 EC의 성숙을 촉진합니다.
발아 부위의 활성화된 대식세포는 효소를 분비하여 가장 안쪽 맥락막인 브루흐막을 소화하여 새싹이 RPE로 이동할 수 있도록 합니다.
현미경으로 싹이 트는 모세혈관을 시각화합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 맥락막 새싹이 덮인 면적을 측정합니다.
맥락막 발아 영역이 더 크면 외식편에서 진행성 맥락모세혈관이 발아되었음을 나타냅니다.
해동된 BME 30마이크로리터를 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰 중앙에 추가합니다. BME의 물방울이 가장자리에 닿지 않고 플레이트 바닥에 볼록한 돔을 형성하는지 확인하십시오.
BME 중앙에 티슈를 놓습니다. 맥락막 외식편을 평평하게 하지 마십시오. BME 내에서 조직이 확장되도록 합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 젤이 응고되도록 합니다. 그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 완전한 클래식 배지를 추가합니다. 격일로 클래식 매체를 변경하십시오.
맥락막 발아는 현미경으로 3일 후에 관찰할 수 있습니다. 맥락막 발아 이미지를 이미지 J로 열고 "이미지 | 유형 | 및 8비트"를 그레이스케일로 사용합니다. 그런 다음 "이미지 | 조정 | 밝기/대비"를 선택하고 조정합니다.
"마술 지팡이" 기능을 사용하여 새싹 중앙에 있는 맥락막 조직의 윤곽을 그려 제거합니다. 무료 선택 도구를 사용하여 이미지의 배경을 제거합니다.
다음으로 "이미지 | 조정 | 임계값 "을 사용하고 "임계값" 기능을 사용하여 배경과 주변에 대한 미세혈관 새싹을 정의합니다. "F2"를 클릭하면 요약이 나타납니다. "저장"을 클릭하여 나중에 참조할 수 있도록 선택한 영역의 이미지를 원본 이미지와 동일한 폴더에 저장합니다.
샘플 그룹을 측정한 후 분석을 위해 기록된 데이터를 복사합니다.