세포의 단백질 인산화를 모니터링하기 위한 시간 분해 Forster 공명 에너지 전달

특정 세포 단백질의 인산화는 활성화 또는 비활성화로 이어지는 주요 조절 메커니즘입니다.

특정 단백질 인산화를 모니터링하려면 부착 세포가 포함된 배양 플레이트를 가져 와십시오. 세포 내 단백질의 인산화를 촉진하기 위해 자극제로 세포를 처리합니다. 사용한 배지를 흡인하고 세포 용해 완충액과 포스파타제 억제제 칵테일을 첨가합니다.

완충액 성분은 세포 용해를 일으켜 인산화 및 비인산화 단백질과 함께 세포 내용물을 방출합니다. 억제제 칵테일은 세포 포스파타제를 비활성화하므로 인산화된 단백질은 그대로 유지됩니다.

세포 용해물을 저용량 검출 플레이트로 옮깁니다. 서로 다른 빛에 민감한 형광단에 부착된 기증자 및 수용체 항체로 용해물을 처리합니다.

배양하는 동안 기증자 항체는 테스트 단백질의 특정 에피토프를 인식하여 단백질의 인산화 및 비인산화 변이체에 결합할 수 있습니다. 대조적으로, 수용체 항체는 시험 단백질의 인산화된 형태에 독점적으로 결합합니다.

이 결합은 인산화된 단백질 변이체에서 수용체 형광단을 기증자 형광단 근처로 가져옵니다. 이러한 근접성은 두 개의 빛에 민감한 형광단 사이의 거리 의존적 에너지 전달 현상인 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 유발합니다.

FRET 호환 마이크로플레이트 리더기에서 플레이트를 읽습니다.

조명이 켜지면 기증자 형광단이 흥분됩니다. 이것은 수용체 분자로의 에너지 전달을 촉발하며, 이는 세포의 테스트 단백질 인산화 수준과 상관관계가 있는 수명이 긴 형광 신호를 방출합니다.

분석을 수행하려면 사전 최적화된 밀도로 50마이크로리터의 세포를 적절한 배양 배지의 96웰 조직 배양 처리된 플레이트에 분배합니다. 그런 다음 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.

다음날, 폴리프로필렌 96웰 플레이트의 12웰에 걸쳐 무혈청 배지에서 화합물을 연속적으로 희석하여 테스트 화합물의 중간 2배 및 4배 희석 시리즈를 준비합니다. 세포 자극을 위해 자극제를 2X 농도로 포함하는 무혈청 배지 50마이크로리터를 추가하고 실온 또는 37도에서 사전 최적화된 시간 동안 세포를 배양합니다.

세포 억제의 경우, 억제제를 4X 농도로 함유한 무혈청 배지 25마이크로리터를 첨가하고, 실온 또는 37도에서 미리 최적화된 시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 자극제를 4배 농도로 포함하는 무혈청 배지 25마이크로리터를 첨가하고 미리 최적화된 시간 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 용해하