JoVE 실험 백과사전
생물학적 기술
0 조회수 • 4:00 분 • July 8th, 2025
뉴런이 돌출을 발달시키는 신경돌기 성장은 신경 기능과 재생에 매우 중요합니다.
시험관 내에서 신경돌기 성장 촉진 시험 화합물의 신경독성 효과를 평가하기 위해 분화 배지에서 인간 신경 전구 세포, hNPC, 현탁액을 얻습니다.
폴리-L-라이신과 라미닌으로 코팅된 멀티웰 플레이트 웰에 세포를 시딩하여 웰 바닥에 세포 부착을 촉진하고 세포 성장을 지원합니다. 분화 배지 성분은 hNPC를 뉴런으로 분화하는 것을 촉진합니다.
신경돌기 성장 촉진 테스트 화합물로 웰 한 세트를 처리합니다. 이것은 hNPC 유래 뉴런과 상호 작용하고 세포 대사 과정과 주요 세포 에너지원인 아데노신 삼인산(ATP)의 후속 농도를 방해하지 않고 신경돌기 성장을 유도할 수 있습니다.
세제, 루시페라아제 효소, 루시페라아제 기질, 루시페린, ATPase 억제제를 함유한 1단계 시약을 마그네슘 이온과 함께 첨가하고 혼합합니다.
세제는 세포막을 파괴하여 세포 용해와 세포 내 ATP를 용액으로 방출합니다. ATPase 억제제는 방출된 내인성 ATPase를 억제하여 ATP 측정을 방해할 수 있습니다. 원심분리기, 세포 파편 침전.
배양하는 동안 마그네슘 이온과 함께 방출된 ATP는 루시페린이 루시페라아제에 결합하게 하여 루시페린이 고향 옥시루시페린으로 산화되어 기저 상태로 이완될 때 생물발광 광자를 방출합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 ATP 농도를 나타내는 발광을 측정합니다.
ATP 농도가 높을수록 세포 생존율이 높다는 것을 나타내며, 이는 뉴런에 대한 유의미한 시험 화합물 독성이 없음을 시사합니다.
플레이트를 코팅하려면 384웰 플레이트의 각 웰에 30마이크로리터의 폴리-L-라이신을 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS로 두 번 세탁하고 약 30분 동안 건조시킵니다.
각 웰에 30마이크로리터의 라미닌을 첨가한 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. PBS로 세척을 반복하고 세포 도금을 진행합니다. 25마이크로리터의 분화 배지에 20,000개의 단일 세포 신경구를 384웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5일 동안 배양합니다.
단일 세포로 분해된 정확한 수의 신경구를 도금하려면 고정밀 피펫팅 기술이 필요합니다. 따라서 보다 재현 가능한 결과를 얻기 위해 도금 전에 신경구를 뉴런으로 분화하는 것이 좋습니다.
배양 후, 원하는 농도의 6배로 각 웰에 5마이크로리터의 시험 화합물을 첨가하고 세포를 추가로 24시간 동안 배양합니다.
세포 생존율 분석을 수행하려면 각 웰에 30마이크로리터의 발광 시약을 추가하고 플레이트를 셰이커에 2분 동안 그대로 둡니다. 플레이트를 300-400배 g에서 30초 동안 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 10분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 배양 후 마이크로플레이트 리더에서 발광을 측정합니다.