특정 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 Split Luciferase Complementation Assay

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단백질-단백질 상호 작용은 중요한 세포 기능에 매우 중요합니다.

막관통 단백질(세포막의 지질 이중층을 가로지르는 막 단백질) 간의 상호 작용을 연구하려면 부착된 포유류 세포 배양이 포함된 다중 웰 플레이트의 웰에서 시작합니다.

다음으로, 적절한 형질감염제와 한 쌍의 발현 플라스미드를 포함하는 용액을 추가합니다.

발현 플라스미드 중 하나는 루시페라아제 효소의 작은 비기능적 단편에 융합된 관심 있는 막관통 단백질을 암호화하고; 다른 플라스미드는 루시페라아제 효소의 큰 비기능적 단편에 융합된 관심 있는 제2 막관통 단백질을 암호화한다.

플레이트를 배양합니다. 형질감염제는 발현 플라스미드의 세포 흡수를 촉진합니다.

성공적으로 형질감염된 세포는 막관통 단백질을 발현합니다. 발현된 막관통 단백질 사이의 상호 작용은 세포질을 마주하는 크고 작은 단편을 근접시켜 결합하여 활성 루시페라아제 효소를 형성하게 합니다.

배경 발광을 최소화하기 위해 웰의 배지를 무혈청 배지로 교체하십시오. 세포 투과성 루시페라아제 기질인 푸리마진(furimazine) 용액을 첨가합니다. 푸리마진이 세포에 들어간 후 루시페라아제가 푸리마진을 산화시켜 고강도 발광을 생성합니다.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 막관통 단백질 간의 강한 상호 작용을 암시하는 발광을 측정합니다.

트립신화를 통해 부착된 HEK293T 세포 배양액을 수확하고 세포를 전용 완전 성장 배지에 다시 현탁합니다. 세포를 투명한 바닥, 흰색 면, 96웰 플레이트에 도금합니다. 반복실험을 포함하여 테스트된 모든 조합 및 대조군을 수용하도록 총 웰 수를 조정합니다. 그런 다음 표준 조건에서 밤새 세포를 배양합니다.

다음날, 발현 플라스미드의 원하는 조합으로 세포를 형질감염시킵니다. 무혈청 배지에서 플라스미드를 각 구축물에 대해 마이크로리터당 6.25나노그램으로 희석하고 적절한 지질 대 DNA 비율로 지질 기반 형질감염 시약을 첨가합니다.

제조업체의 지침에 따라 플라스미드를 배양합니다. 그런 다음 8마이크로리터의 지질-DNA 혼합물을 지정된 웰에 추가합니다. 플레이트의 내용물을 부드럽게 회전시키면서 혼합하고 표준 조건에서 20-24시간 동안 세포를 배양합니다.

다음날, 각 웰의 컨디셔닝된 배지를 100마이크로리터의 무혈청 배지로 교체하여 배지 교환 시 세포가 분리되지 않도록 합니다.

발광을 측정하기 직전에 1부피의 푸리마진과 19부피의 희석 완충액을 혼합합니다. 각 웰에 25마이크로리터의 푸리마진 작업 용액을 넣고 손으로 또는 궤도 셰이커로 플레이트를 부드럽게 혼합합니다.

플레이트를 발광 마이크로플레이트 리더기에 삽입하고 플레이트를 섭씨 37도에서 10-15분 동안 평형을 유지합니다. 분석할 웰을 선택하고 0.3초의 통합 시간으로 발광을 읽습니다. 필요한 경우 최대 2시간 동안 발광을 계속 모니터링합니다.

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