조직 용해물에서 표적 단백질을 추정하기 위한 정량적 점 블롯

정량적 도트 블롯(QDB)은 시료 내 표적 단백질의 농도를 정량화하는 데 유용한 기술입니다. 샘플이 고분자 멤브레인에 고정되면 면역블로팅을 통해 단백질을 검출할 수 있습니다.

시작하려면 각 웰의 바닥에 니트로셀룰로오스 멤브레인이 부착된 멀티웰 플레이트인 QDB 플레이트를 가져갑니다. 표적 단백질을 포함하는 조직 용해물인 샘플을 웰 내부의 막 중앙에 추가합니다.

샘플을 건조시키십시오. 표적 단백질은 비공유 상호 작용을 통해 막에 결합합니다.

차단 솔루션을 추가합니다. 용액의 단백질은 멤브레인의 결합되지 않은 부위에 부착되어 검출 시약의 비특이적 결합을 방지합니다.

다음으로, 샘플의 표적 단백질에 결합하는 1차 항체를 포함하는 용액을 추가합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오.

그런 다음 2차 항체 용액을 추가합니다. 과산화효소 효소로 표지된 이 분자는 단백질 결합 1차 항체에 결합합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오.

마지막으로 화학발광 기질과 과산화수소를 포함하는 용액을 첨가합니다. 과산화수소를 이용하여 항체 결합 과산화효소가 기질을 산화시키고 빛을 방출합니다. 플레이트 리더를 사용하여 샘플의 발광 강도를 측정합니다.

알려진

농도의 표적 단백질로 연속 희석을 사용하여 표준 발광 곡선을 생성합니다. 표적 단백질 농도를 결정하기 위해 곡선에 샘플의 측정된 발광 값을 플로팅합니다.

이 절차에서는 플레이트 바닥이 테이블 표면에 닿지 않도록 빈 피펫 팁 상자를 QDB 플레이트 아래에 놓습니다. 최대 2마이크로리터의 샘플을 QDB 플레이트의 개별 장치 하단에 있는 멤브레인 센터에 로드합니다.

적재하는 동안 QDB 플레이트의 바닥이 표면에 닿지 않도록 하고 개별 우물에 너무 많은 적재를 하지 마십시오. 우물당 4마이크로리터 이하를 경험할 수 있습니다.

그런 다음 로드된 QDB 플레이트를 실온에서 1시간 동안 방치하거나 로드된 플레이트를 통풍이 잘 되는 공간에서 섭씨 37도에서 15분 동안 방치합니다. 플레이트를 차단하려면 QDB 플레이트를 전사 버퍼에 담그고 10초 동안 부드럽게 흔듭니다.

그런 다음 QDB 플레이트를 TBST로 부드럽게 세 번 헹구고 TBST에서 지속적으로 흔들면서 5분 동안 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 차단 완충액으로 QDB 플레이트를 지속적으로 흔들면서 1시간 동안 차단합니다. 이제 차단 완충액에서 1차 항체를 선택한 농도로 희석하고 일반 96웰 플레이트의 각