단백질 발현 수준을 추정하기 위한 정량적 웨스턴 블로팅(Quantitative Western Blotting)

총 단백질 정규화 기반 기술인 정량적 웨스턴 블로팅은 표적 단백질 발현 수준을 정량화하는 데 유용합니다.

시작하려면 조직 용해물을 폴리아크릴아미드 그래디언트 겔의 웰에 로드합니다. 용해물에는 다른 세포 단백질과 함께 표적 단백질이 포함되어 있습니다.

구배를 따라 샘플 단백질의 전기영동 분리를 위해 적절한 전압에서 겔을 실행합니다. 완료되면 전사 스택의 고분자 멤브레인 위에 젤을 놓습니다.

전류를 가하여 분리된 단백질을 멤브레인으로 전달합니다. 다음으로, 멤브레인을 형광 총 단백질 염색에 넣습니다. 염색의 하전된 염료 분자는 막의 모든 단백질에 정전기적으로 결합합니다.

차단 솔루션을 추가합니다. 따라서 용액의 단백질은 막에 결합합니다. 검출 시약의 비특이적 결합을 방지합니다. 표적 단백질에만 결합하는 1차 항체를 추가합니다. 그런 다음 1차 항체에 부착되는 형광단으로 표지된 2차 항체를 추가합니다.

레이저로 샘플을 여기시킵니다. 전체 단백질 염색의 염료 분자와 항체 결합 형광단에서 방출된 형광을 해당 파장으로 기록합니다.

정규화된 단백질 로딩 값을 계산하려면 각 레인의 총 단백질 신호를 가장 높은 값으로 나눕니다. 표적 단백질 신호를 해당 정규화된 로딩 값으로 나누어 표적 단백질의 상대적 발현을 결정합니다.

전기영동의 경우, 겔 전기영동 챔버 시스템에 프리캐스트 4-12% Bis-Tris 그래디언트 겔을 설정하고 3.5마이크로리터의 단백질 표준물질을 웰에 로드합니다. 멤브레인 간 정규화를 위해 내부 표준을 사용하는 경우 단백질 사다리 옆에 있는 처음 3개의 웰에 다른 샘플과 동일한 양을 로드하고 나머지 웰에 각 샘플 30마이크로그램을 로드합니다. 그런 다음 샘플을 스태킹 젤을 통해 80볼트에서 10분 동안 실행한 다음 150볼트에서 추가로 45-60분 동안

전기영동이 끝나면 전사 스택을 조립하기 위해 단백질 겔을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인이 포함된 하단 스택에 놓은 다음 여과지를 놓습니다. 블로팅 롤러를 사용하여 기포를 제거하고 상단 스택을 여과지 상단에 놓은 후 스택을 다시 굴려 기포를 제거합니다.

장치 왼쪽에 전극이 있는 전체 스택을 이송 장치로 옮기고 젤 스폰지를 스택 위에 놓아 스폰지가 장치의 해당 전기 접점과 정렬되도록 합니다.

뚜껑을 닫은 후 적절한 프로그램을 선택하고 시작합니다. 프로그램이 끝나면 멤브레인을 젤 크기로 자르고 절단된 멤브레인을 이중 증류수로 빠르게 세척한 후 전체 단백질 염색을 계속합니다.

전체 단백질 염색을 위해 멤브레인을 단백질 쪽이 안쪽을 향하도록 50밀리리터 튜브에 굴리고 롤러에 5밀리리터의 단백질 염색 용액으로 멤브레인을 표지하여 훈막에서 실온에서 5분 동안

배양이 끝나면 5밀리리터의 세척액으로 멤브레인을 빠르게 세척하고 세척 사이에 튜브를 롤러로 잠시 되돌린 다음 초순수로 잠시 헹굽니다. 멤브레인에 3mm의 차단 완충액을 첨가하고 멤브레인을 실온에서 30분 동안 롤러에 되돌립니다. 차단 완충액을 적절한 최적화된 농도의 관심 1차 항체로 교체하고 멤브레인을 롤러에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

다음날 실온에서 롤러에서 세척할 때마다 5밀리리터의 신선한 PBS로 멤브레인을 5분 동안 6회 세척합니다. 마지막 세척 후, 멤브레인을 롤러의 적절한 2차 항체 용액과 함께 실온에서 1시간 동안 배양한 후 세척당 30분 동안 3회 세척합니다. 마지막 세탁 후 멤브레인을 건조시키고 알루미늄 호일을 사용하여 멤브레인을 빛으로부터 보호합니다.

이미지 획득을 위해 단백질 면이 아래를 향하도록 멤브레인을 스캐너에 놓고 소프트웨어에서 스캔 영역을 선택합니다. 그런 다음 두 채널 모두에서 이미지를 획득하고 이미지를 적절한 이미지 분석 프로그램으로 내보냅니다.

700나노미터 채널을 표시하여 전체 단백질 염색 결과를 표시하고 "분석"을 선택하고 직사각형을 그려 정규화를 위한 관심 영역을 정의합니다. 그런 다음 첫 번째 직사각형 영역을 복사하여 각 개별 샘플에 붙여넣어 정의된 영역이 분석된 모든 레인에 대해 동일한 크기인지 확인합니다.

각 레인의 단백질 농도를 정량화하려면 총 단백질 염색과 관심 단백질의 결과를 스프레드시트 프로그램에 복사하고 가장 높은 총 단백질 염색 신호를 결정합니다. 그런 다음 각 총 단백질 염색 신호 값을 이 값으로 나누어 정규화된 단백질 로딩 값을 얻고, 각 개별 샘플의 800나노미터 신호 값을 해당 정규화된 단백질 값으로 나누어 서로 다른 샘플의 상대 단백질 발현 비율을 계산합니다.