단백질 발현 수준을 추정하기 위한 정량적 웨스턴 블로팅(Quantitative Western Blotting)

총 단백질 정규화 기반 기술인 정량적 웨스턴 블로팅은 표적 단백질 발현 수준을 정량화하는 데 유용합니다.

시작하려면 조직 용해물을 폴리아크릴아미드 그래디언트 겔의 웰에 로드합니다. 용해물에는 다른 세포 단백질과 함께 표적 단백질이 포함되어 있습니다.

구배를 따라 샘플 단백질의 전기영동 분리를 위해 적절한 전압에서 겔을 실행합니다. 완료되면 전사 스택의 고분자 멤브레인 위에 젤을 놓습니다.

전류를 가하여 분리된 단백질을 멤브레인으로 전달합니다. 다음으로, 멤브레인을 형광 총 단백질 염색에 넣습니다. 염색의 하전된 염료 분자는 막의 모든 단백질에 정전기적으로 결합합니다.

차단 솔루션을 추가합니다. 따라서 용액의 단백질은 막에 결합합니다. 검출 시약의 비특이적 결합을 방지합니다. 표적 단백질에만 결합하는 1차 항체를 추가합니다. 그런 다음 1차 항체에 부착되는 형광단으로 표지된 2차 항체를 추가합니다.

레이저로 샘플을 여기시킵니다. 전체 단백질 염색의 염료 분자와 항체 결합 형광단에서 방출된 형광을 해당 파장으로 기록합니다.

정규화된 단백질 로딩 값을 계산하려면 각 레인의 총 단백질 신호를 가장 높은 값으로 나눕니다. 표적 단백질 신호를 해당 정규화된 로딩 값으로 나누어 표적 단백질의 상대적 발현을 결정합니다.

전기영동의 경우, 겔 전기영동 챔버 시스템에 프리캐스트 4-12% Bis-Tris 그래디언트 겔을 설정하고 3.5마이크로리터의 단백질 표준물질을 웰에 로드합니다. 멤브레인 간 정규화를 위해 내부 표준을 사용하는 경우 단백질 사다리 옆에 있는 처음 3개의 웰에 다른 샘플과 동일한 양을 로드하고 나머지 웰에 각 샘플 30마이크로그램을 로드합니다. 그런 다음 샘플을 스태킹 젤을 통해 80볼트에서 10분 동안 실행한 다음 150볼트에서 추가로 45-60분 동안

실행합니다.

전기영동이 끝나면 전사 스택을 조립하기 위해 단백질 겔을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인이 포함된 하단 스택에 놓은 다음 여과지를 놓습니다. 블로팅 롤러를 사용하여 기포를 제거하고 상단 스택을 여과지 상단에 놓은 후 스택을 다시 굴려 기포를 제거합니다.

장치 왼쪽에 전극이 있는 전체 스택을 이송 장치로 옮기고 젤 스폰지를 스택 위에 놓아 스폰지가 장치의 해당 전기 접점과 정렬되도록 합니다.

뚜껑을 닫은 후 적절한 프로그램을 선택하고 시작합니다. 프로그램이 끝나면 멤브레인을 젤 크기로 자르고 절단된 멤브레인을 이중 증류수로 빠르게 세척한 후 전체