불균일한 집단에서 표적 검증 시 단일 세포 해상도가 중요한 이유는 무엇인가요?

단일 세포 해상도는 벌크 분석(bulk assay)에서 가려지는 단백질 발현의 이질성을 드러내어, 세포 하위 유형 전반에 걸쳐 표적 결합이 균일할 것이라는 잘못된 가정을 방지하므로 표적 검증에 매우 중요합니다. 이를 통해 표적 특이성을 더욱 정확하게 평가할 수 있으며, 활성 하위 집단을 반영하지 못하는 평균 신호에 기반하여 표적을 추진할 위험을 줄일 수 있습니다.

마이크로웰에서 단일 세포를 분리하는 것이 발견 워크플로우의 분석 재현성을 어떻게 향상시키나요?

마이크로웰에서 단일 세포를 분리하면 각 웰에 분석을 위한 단일 세포만 포함되도록 보장하여, 세포 이중체나 빈 웰로 인한 변동성을 최소화함으로써 분석 재현성을 높일 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 단일 세포 점유율 15-20% 및 다중 세포 웰 2% 미만을 목표로 하며, 이를 통해 입력물을 표준화하고 반복 실험 간에 일관된 단백질 추출 및 검출을 지원합니다.

개별 세포 간의 단백질 발현량을 비교할 수 있게 하는 정량적 측정 방법은 무엇입니까?

형광 강도 측정은 표적 단백질 마커의 발현 수준에 정비례하므로, 개별 세포 간의 단백질 발현량을 비교할 수 있게 해줍니다. 이러한 정량적 판독을 통해 연구자는 마커 발현도에 따라 세포의 순위를 매기고, 표적 결합도가 높거나 낮은 하위 집단을 식별할 수 있습니다.

타겟 검증의 교차 기능적 협업에서 복제 요구 사항이 중요한 이유는 무엇입니까?

재현성 요건은 단백질 발현 패턴이 여러 실험에서 일관되게 나타남을 보장하여 타겟 유효성에 대한 신뢰를 높이고, 발견, 분석법 개발 및 전임상 팀 간의 조율을 지원하므로 부서 간 협업에 있어 중요합니다. 일관된 재현성은 리드 최적화 또는 IND 신청 가능 연구를 위해 타겟을 인계할 때 발생할 수 있는 모호성을 줄여줍니다.

스크리닝 캐스케이드에서 단일 세포 웨스턴 블로팅을 구현하기 전에 어떤 통계 분석이 필요한가요?

실행에 앞서, 연구팀은 음성 대조군 및 이소타입 대조군을 기반으로 양성 신호와 음성 신호를 구분하는 형광 강도 임계값을 설정하여, 단백질 양성 세포를 객관적으로 분류할 수 있도록 해야 합니다. 이는 Z'-factor 또는 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)와 같은 통계적 방법을 사용하여 분석 품질과 화합물 스크리닝 캠페인 준비 상태를 평가하는 것을 지원합니다.

세포 이질성을 결정하기 위한 Single-Cell Western Blotting

JoVE Encyclopedia of Experiments

생물학적 기술

0 조회수 • 4:43 분 • July 8th, 2025

염증 부위에는 단핵구, 대식세포, 백혈구 등 다양한 면역 세포가 포함되어 있습니다.

단일 세포 웨스턴 블로팅으로 이질적인 세포 집단을 식별하려면 블록으로 패턴화된 광활성화성 폴리아크릴아미드 겔로 구성된 사전 수화 블로팅 칩을 사용합니다. 각 블록에는 수많은 마이크로웰이 있습니다. 여러 블록으로 패턴화하면 여러 셀이 병렬로 캡처됩니다.

이질적인 세포 집단을 포함하는 현탁액을 추가합니다. 우물의 크기는 단일 세포가 침전될 수 있도록 합니다. 적절한 완충액으로 채워진 전기영동 챔버에 칩을 담그십시오. 완충액의 세제 분자는 세포막을 파괴하여 세포 내용물을 방출합니다.

전기장을 적용합니다. 방출된 단백질은 겔을 가로질러 이동하여 서로 다른 크기의 밴드로 분리됩니다. 칩을 세척 완충액으로 세척하여 비특이적으로 결합된 분자를 제거하고 원하는 마커 단백질을 포함한 세포 단백질만 남깁니다.

젤을 자외선에 노출시켜 표면을 활성화하고 단백질을 고정시킵니다.

각 세포 유형에 고유한 마커 단백질에 특이적으로 결합하여 단백질-1차 항체 복합체를 형성하는 1차 항체 칵테일을 추가합니다. 각각의 1차 항체에 결합하여 해당 세포 특이적 마커 단백질을 표지하는 형광 태그가 부착된 2차 항체의 혼합물을 분배합니다.

칩을 스캐너에 넣습니다. 샘플 세포 현탁액의 단일 세포에 특이적인 해당 단백질 마커의 발현 수준에 비례하는 형광 강도를 측정합니다.

단일 세포 웨스턴 블롯 분석의 경우, 10cm 페트리 접시 바닥에 있는 재수화된 단일 세포 웨스턴 블롯 칩에 희석된 단일 세포 현탁액 1밀리리터를 추가합니다. 5-15분 후, 명시야 현미경으로 칩을 검사합니다. 마이크로웰의 약 15%에서 20%는 단일 셀에 의해 점유되어야 하며, 웰의 2% 미만은 두 개 이상의 셀을 포함해야 합니다.

칩이 제대로 로드된 경우 접시를 45도 기울이고 현탁액 완충액으로 칩을 세 번 세척하여 포획되지 않은 세포를 제거합니다. 마지막 세척 후, 칩을 단일 셀 웨스턴 기기의 전기영동 셀에 젤 면이 위로 향하도록 조심스럽게 로드하고 전체 단일 셀 웨스턴 블롯 칩을 용해/실행 완충액으로 덮습니다. 세포 용해를 시작하고 적절한 실험 매개변수에 따라 기기를 실행합니다.

실행이 끝나면 실온에서 세척할 때마다 신선한 세척 완충액으로 10분 동안 두 번 세척하여 칩을 헹구십시오. 두 번째 세척 후, 80마이크로리터의 관심 있는 1차 항체 용액을 항체 프로빙 챔버에 추가하고 칩 겔 쪽을 아래로 내려 항체 용액이 칩을 가로질러 심지도록 합니다.

실온에서 2시간 후 칩을 세척 완충액에 세 번 세척하고 셰이커의 물에 한 번 세척합니다. 칩을 적절한 2차 항체와 함께 빛으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 세척 완충액으로 칩을 세 번 세척하고 슬라이드 스피너에서 칩을 회전시켜 남아 있는 세척 완충액을 제거합니다.

단일 셀 웨스턴 블롯 칩을 제거하려면 50밀리리터 튜브 랙을 60도 수조에 넣고 랙 위 1cm 위에 물을 놓습니다. 흄 후드에 40밀리리터의 스트리핑 완충액과 320마이크로리터의 베타-메르캅토에탄올을 캐니스터에 추가합니다. 칩을 캐니스터 내부의 10cm 페트리 접시에 넣고 캐니스터를 파라필름으로 밀봉합니다.

그런 다음 수조의 튜브 랙 안에 캐니스터를 놓습니다. 90분 후 칩을 새 페트리 접시에 조심스럽게 옮기고 칩을 세척 완충액으로 한 번 잠시 세척한 후 페트리 접시에 신선한 세척 완충액 15밀리리터를 첨가하여 셰이커에서 15분 동안 세척합니다.