마우스 배아 줄기 세포 게놈에서 상동 재조합을 검출하기 위한 서던 블로팅(Southern Blotting)

Southern blotting은 프로브 기반 검출을 통해 복잡한 DNA 혼합물에서 특정 DNA 서열을 식별하는 것을 포함합니다.

Southern blotting을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포에서 상동 재조합 또는 HR 이벤트를 식별하려면 세포에서 게놈 DNA를 얻습니다. 제한 효소와 함께 배양하여 DNA를 더 작은 단편으로 소화합니다.

DNA를 아가로스 겔에 로드합니다. 크기 기반 단편 분리를 위해 전기영동을 수행합니다.

젤을 산성 용액으로 처리하여 퓨린 염기를 제거하고 이중 가닥 DNA, dsDNA를 느슨하게 합니다. 알칼리성 변성 용액을 첨가하십시오. 높은 pH는 수소 결합을 파괴하여 느슨해진 dsDNA를 단일 가닥 DNA, ssDNA로 변성시킵니다. 겔 pH를 중화하기 위해 중화 용액과 함께 배양합니다.

블로팅지, 나일론 멤브레인 및 멤브레인 위에 쌓인 젤을 사용하여 전사 시스템을 조립합니다. 전송을 수행합니다. ssDNA는 하향 모세관 작용을 통해 겔에서 막으로 전달됩니다.

멤브레인에 자외선을 조사하여 DNA를 가교 및 고정시킵니다. 혼성화 용액이 들어 있는 튜브에 멤브레인을 놓습니다. 회전과 함께 배양하여 멤브레인을 코팅하고 비특이적 프로브 결합을 방지합니다.

마지막으로, 단일 가닥 방사성 표지 프로브를 포함하는 혼성화 완충액과 함께 멤브레인을 배양합니다. 프로브는 서열 상보성을 통해 특정 DNA 영역에 결합합니다.

멤브레인을 세척하고 결합되지 않은 프로브를 제거합니다. 멤브레인을 X선에 노출시킵니다. 멤브레인의 뚜렷한 밴드는 HR 이벤트를 포함하는 DNA 영역과 제어 영역을 구별합니다.

각 gDNA에 대해 Dra I용 10X 완충액 30마이크로리터, Dra I 3마이크로리터, 샘플당 gDNA 10마이크로그램을 혼합합니다. 최종 부피가 30마이크로리터가 될 때까지 물을 넣고 섭씨 37도에서 밤새 배양하여 gDNA를 소화합니다.

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티듐 브로마이드가 포함된 1% 아가로스 전기영동 젤을 준비합니다. 이전에 획득한 샘플을 1Kb 사다리와 함께 젤에 로드하고 밤새 30-40볼트에서 실행합니다. 다음날 0.2뉴턴 염산 용액이 들어 있는 트레이에 젤을 담그십시오. 셰이커를 사용하여 실온에서 20분 동안 트레이를 부드럽게 흔듭니다.

젤을 DNA 변성 용액이 들어 있는 트레이로 옮깁니다. 실온에서 20분간 부드럽게 흔든다. 그런 다음 젤을 DNA 중화 용액이 들어 있는 트레이에 옮기고 실온에서 20분 동안 부드럽