0 조회수 • 8:51 분 • July 8th, 2025
마이크로RNA, miRNA는 작고 단일 가닥의 비암호화 RNA입니다. miRNA는 다중 단백질 복합체에 통합되고 상보적인 표적 mRNA 서열에 추가로 결합하여 유전자 발현을 부정적으로 조절합니다.
식물 조직의 총 RNA에서 특정 miRNA를 검출하려면 추적 염료와 RNA 변성제인 포름아미드를 포함하는 겔 로딩 염료를 추가합니다. 시료를 가열하여 RNA를 변성시키고 전기영동 전에 2차 구조 형성을 방지합니다.
샘플과 표준 RNA 마커를 사전 조립된 변성 폴리아크릴아미드 겔의 웰에 로드합니다. 전기영동을 실행하여 RNA 단편의 크기 기반 분리를 용이하게 합니다.
젤을 전기 블로팅 카세트의 미리 젖은 여과지에 옮깁니다. 완충액에 적신 나일론 블로팅 멤브레인을 겔 위에 정렬합니다. 그런 다음 미리 젖은 여과지를 쌓습니다. 전기 블로팅을 수행합니다.
전류는 miRNA를 포함하여 음전하를 띤 RNA를 젤에서 양전하를 띤 나일론 멤브레인 표면으로 이동하게 합니다. 멤브레인을 자외선에 노출시키십시오. 이는 RNA를 막에 가교하여 RNA 손실을 방지합니다.
배경 소음을 줄이기 위해 비특이적 결합 부위를 차지하는 차단제를 포함하는 혼성화 완충액에서 멤브레인을 배양합니다.
표적 miRNA에 상보적인 방사성 표지 RNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가하여 특이적으로 결합합니다. 멤브레인을 완충액으로 세척하고 결합되지 않은 프로브를 제거합니다.
형광체 이미징 시스템을 사용하여 방사성 혼성화 신호 강도를 감지하고 정량화합니다. 고분해능 신호는 식물 조직에서 특정 miRNA 발현을 나타냅니다.
젤의 사전 실행을 중지합니다.
웰 내부의 요소 침전물을 제거하기 위해 샘플을 적재하기 전에 웰을 철저히 세척하십시오. 재현탁된 RNA 샘플을 98도에서 1분 동안 가열합니다. 모세관 팁을 사용하여 샘플을 뜨겁게 웰에 로드합니다. 기포가 생기지 않도록 하십시오.
모든 샘플의 로딩을 완료하고 뚜껑을 조립합니다. 젤을 80볼트에서 3시간 동안 또는 브로모페놀 블루가 완전히 흐를 때까지 실행합니다. 전사를 위해 양전하를 띤 나일론 멤브레인을 사용하십시오. 유리판의 치수로 자릅니다. 오른쪽 상단 모서리에 멤브레인에 레이블을 지정합니다. 멸균 Milli-Q 물 표면에 멤브레인을 부드럽게 놓습니다. 라벨 면이 수면을 향하도록 아래를 향하도록 하십시오.
깨끗한 트레이를 가져다가 전기 전사를 위해 젤 샌드위치를 준비합니다. 카세트의 회색 면을 아래로 놓습니다. 카세트 높이보다 약간 높은 곳에 1X TBE를 붓습니다. 섬유 패드를 1X TBE로 미리 적시고 짜서 기포를 제거합니다. 압지 두 장을 섬유 패드 크기로 자릅니다.
압지를 1X TBE로 미리 적시고 섬유 패드 위에 놓습니다. 플라스틱 피펫을 종이 위로 굴려 기포를 제거합니다. 하나의 1X TBE에 다른 압지를 미리 적시고 카세트 위에 놓습니다. 기포를 제거하기 위해 롤오버합니다. 이제 샌드위치 설정이 전기 전사를 할 준비가 되었습니다.
전기영동이 완료되면 실행을 중지하고 장치에서 뚜껑을 제거합니다. 설정에서 실행 중인 카세트를 제거합니다. 실행 중인 카세트에서 유리판을 꺼냅니다.
어셈블리에서 젤을 조심스럽게 제거합니다. 첫 번째 로드된 RNA 샘플이 오른쪽을 향하도록 압지 위에 놓습니다. 미리 담근 멤브레인을 1X TBE에 부드럽게 담그고 라벨 면이 아래로 향하도록 젤 위에 놓습니다. 멤브레인과 젤이 건조되지 않도록 하십시오. 기포를 제거하기 위해 부드럽게 굴립니다.
압지 한 장을 1X TBE에 담그고 멤브레인 위에 놓습니다. 기포를 제거하십시오. 압지를 한 장 더 놓고 기포를 제거합니다. 어셈블리 위에 섬유 패드를 놓아 샌드위치를 완성합니다. 카세트를 단단히 닫습니다.
트랜스블롯 카세트를 모듈에 넣습니다. 탱크에 1X TBE, pH 8.2를 블로팅 마크까지 채웁니다. 장치의 뚜껑을 닫고 10도에서 밤새 4볼트로 또는 냉장실에서 옮깁니다. UV 가교제를 준비하고 전기 전사가 완료되기 직전에 1,200으로 설정합니다.
전송이 완료되면 모듈에서 카세트를 제거합니다. 광고를 놓습니다.amp 멤브레인을 A4 용지에 표시된 면이 위로 향하도록 합니다. 120밀리줄에서 254나노미터 UV 광선을 조사하여 RNA를 멤브레인에 가교합니다. 가교 블롯은 4도에서 저장하거나 혼성화에 사용할 수 있습니다.
검출해야 하는 작은 RNA와 완전히 상보적인 프로브를 설계하고 PNK 효소를 사용하여 프로브의 5 프라임 말단에 라벨을 붙이고 그림과 같이 구성 요소를 결합합니다. 반응 혼합물을 37도에서 30분 동안 배양합니다.
30분 동안 배양한 후, G-25 컬럼을 사용하여 반응 혼합물에서 표지되지 않은 프로브를 분리합니다. 프로브의 라벨링을 개선하려면 사용하기 전에 G-25 컬럼을 준비하십시오. RNA 면이 위를 향하도록 블롯을 하이브리드화 병 안에 넣습니다. 사용하기 전에 하이브리드화 완충액을 격렬하게 혼합하십시오. 혼성화 완충액 10ml를 첨가하고 혼성화 병을 35도로 유지하여 회전시키는 혼성화 오븐 안에 넣습니다.
20-30분 동안 사전 혼성화를 수행합니다. 사전 하이브리드화 후 오븐에서 병을 꺼냅니다. 표지된 프로브를 하이브리드화 버퍼에 부드럽게 추가합니다. 기포가 생성되지 않도록 하십시오. 블롯을 오븐 내부에서 35도에서 12시간 동안 회전시키면서 배양합니다.
혼성화 후 병에서 혼성화 완충액을 제거합니다. 세척 완충액 I을 사용하여 블롯을 빠르게 세척합니다. 이 단계는 블롯에서 과도한 혼성화 용액을 제거하기 위해 수행됩니다. 또한, 세척 완충액 I을 사용하여 35도에서 30분 동안 블롯을 배양합니다. 35도에서 완충액 II를 사용하여 30분 동안 또 다른 세척을 수행합니다.
얼룩을 씻어낸 후 하이브리드화 커버 안에 넣고 여분의 완충액을 제거하고 밀봉합니다. 카세트 안에 넣고 방사선이 없는 형광체 이미저 스크린에 12시간 동안 노출시킵니다. Typhoon Biomolecular Imager를 사용하여 혼성화 신호를 감지하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다.