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생물학적 기술
0 조회수 • 8:51 분 • July 8th, 2025
마이크로RNA, miRNA는 작고 단일 가닥의 비암호화 RNA입니다. miRNA는 다중 단백질 복합체에 통합되고 상보적인 표적 mRNA 서열에 추가로 결합하여 유전자 발현을 부정적으로 조절합니다.
식물 조직의 총 RNA에서 특정 miRNA를 검출하려면 추적 염료와 RNA 변성제인 포름아미드를 포함하는 겔 로딩 염료를 추가합니다. 시료를 가열하여 RNA를 변성시키고 전기영동 전에 2차 구조 형성을 방지합니다.
샘플과 표준 RNA 마커를 사전 조립된 변성 폴리아크릴아미드 겔의 웰에 로드합니다. 전기영동을 실행하여 RNA 단편의 크기 기반 분리를 용이하게 합니다.
젤을 전기 블로팅 카세트의 미리 젖은 여과지에 옮깁니다. 완충액에 적신 나일론 블로팅 멤브레인을 겔 위에 정렬합니다. 그런 다음 미리 젖은 여과지를 쌓습니다. 전기 블로팅을 수행합니다.
전류는 miRNA를 포함하여 음전하를 띤 RNA를 젤에서 양전하를 띤 나일론 멤브레인 표면으로 이동하게 합니다. 멤브레인을 자외선에 노출시키십시오. 이는 RNA를 막에 가교하여 RNA 손실을 방지합니다.
배경 소음을 줄이기 위해 비특이적 결합 부위를 차지하는 차단제를 포함하는 혼성화 완충액에서 멤브레인을 배양합니다.
표적 miRNA에 상보적인 방사성 표지 RNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가하여 특이적으로 결합합니다. 멤브레인을 완충액으로 세척하고 결합되지 않은 프로브를 제거합니다.
형광체 이미징 시스템을 사용하여 방사성 혼성화 신호 강도를 감지하고 정량화합니다. 고분해능 신호는 식물 조직에서 특정 miRNA 발현을 나타냅니다.
젤의 사전 실행을 중지합니다.
웰 내부의 요소 침전물을 제거하기 위해 샘플을 적재하기 전에 웰을 철저히 세척하십시오. 재현탁된 RNA 샘플을 98도에서 1분 동안 가열합니다. 모세관 팁을 사용하여 샘플을 뜨겁게 웰에 로드합니다. 기포가 생기지 않도록 하십시오.
모든 샘플의 로딩을 완료하고 뚜껑을 조립합니다. 젤을 80볼트에서 3시간 동안 또는 브로모페놀 블루가 완전히 흐를 때까지 실행합니다. 전사를 위해 양전하를 띤 나일론 멤브레인을 사용하십시오. 유리판의 치수로 자릅니다. 오른쪽 상단 모서리에 멤브레인에 레이블을 지정합니다. 멸균 Milli-Q 물 표면에 멤브레인을 부드럽게 놓습니다. 라벨 면이 수면을 향하도록 아래를 향하도록 하십시오.
깨끗한 트레이를 가져다가 전기 전사를 위해 젤 샌드위치를 준비합니다. 카세트의 회색 면을 아래로 놓습니다. 카
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