살아있는 박테리아의 단백질-단백질 상호 작용 특성화를 위한 FLIM-FRET 이미징

형광 수명 이미징 현미경을 사용하여 살아있는 박테리아의 특정 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전달, FRET와 결합된 FLIM은 재조합 박테리아 현탁액으로 시작합니다. 박테리아는 대사 경로에 관여하는 특정 세포질 단백질을 발현하며, FRET에 적합한 기증자 및 수용체 형광 단백질로 표지됩니다.

현미경 슬라이드에 박테리아를 고정시키는 아가로스 패드에서 박테리아 현탁액을 발견합니다. 슬라이드 위에 커버슬립을 놓고 밀봉합니다.

FLIM-FRET 현미경을 위한 2광자 여기 도립 주사 현미경의 스테이지에 슬라이드를 배치합니다. 형광 램프를 사용하여 박테리아 단층에서 관심 영역을 선택하고 스캔합니다.

발현된 세포질 단백질 사이의 상호 작용은 기증자와 수용체 형광 단백질을 적절한 방향으로 더 가깝게 만듭니다. 적절한 파장으로 레이저 조명을 받으면 기증자 형광 단백질이 여기됩니다.

형광 단백질의 근접성은 FRET를 유발하여 공여자에서 수용체 형광 단백질로 비방사 에너지 전달을 유도하고, 이는 여기되어 결국 기저 상태로 돌아가 형광을 방출합니다.

비복사 에너지 전달은 여기된 기증자 형광 단백질이 기저 상태로 돌아가는 데 걸리는 시간, 즉 FLIM으로 측정한 기증자 형광 수명을 줄여줍니다. FRET로 인한 기증자 형광 단백질의 평균 형광 수명의 감소는 박테리아의 단백질-단백질 상호 작용을 확인합니다.

현미경 유리 슬라이드를 평평한 수평면에 놓고 그 주위에 두 겹의 접착 테이프를 붙인 두 개의 유리 슬라이드를 배열합니다. 1% 녹인 아가로스가 담긴 70마이크로리터 방울을 유리 슬라이드에 피펫팅하고 그 위에 네 번째 슬라이드를 놓아 아가로스 방울을 평평하게 만듭니다. 약 1분 동안 부드럽게 누릅니다.

상단 슬라이드를 제거하고 아가로스 패드의 서로 다른 위치에 있는 3-4개의 지점에 약 3마이크로리터의 박테리아를 떨어뜨립니다. 아가로스 패드를 현미경 유리 커버슬립으로 덮고 녹인 파라핀으로 고정하여 네 모서리부터 시작하여 유리 슬라이드에 밀봉합니다.

현미경 슬라이드를 스테이지에 놓고 커버슬립이 대물렌즈를 향하도록 합니다. 필터 큐브 터렛을 돌려 eGFP 큐브를 선택하고 형광 램프 셔터를 엽니다. 그런 다음 형광광을 현미경의 접안렌즈 쪽으로 보냅니다. 현미경 손잡이를 사용하여 박테리아에 대물렌즈의 초점을 맞춥니다.

전동 스테이지를 제어하는 조이스틱을 사용하여 샘플에서 관심 영역을 선택합니다. 형광 방출