Cell Adhesion Molecules 간의 Trans Interaction을 검출하기 위한 Cell Aggregation Assay

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신경계에서 세포간 상호 작용(시냅스 전 및 시냅스 후 뉴런에서 특정 시냅스 세포 접착 분자, 막관통 단백질 간의 상호 작용)은 시냅스에서 복합체를 형성하여 시냅스 간 신호 전달을 매개합니다.

세포 응집 분석을 통해 인간 배아 신장 세포에서 발현된 시냅스 세포 접착 분자 간의 세포 간 상호작용을 검출하려면 형질감염된 세포 현탁액으로 시작합니다.

형질감염된 세포 집단 중 하나는 원하는 시냅스 전 세포 접착 분자 및 녹색 형광 단백질을 발현하고; 다른 하나는 특정 시냅스 후 세포 접착 분자 및 적색 형광 단백질을 발현합니다. 녹색 및 적색 형광 단백질을 발현하는 두 개의 세포 집단도 얻어집니다.

세포를 원심분리합니다. 칼슘 이온이 보충된 적절한 배지에 세포를 재현탁합니다. 두 집단의 형질감염된 세포를 튜브에 균등하게 혼합합니다. 다른 세포 집단에 대해 반복합니다.

배양하는 동안 칼슘 이온은 세포 집단에서 발현되는 시냅스 전 단백질의 특정 부위에 결합합니다. 이것은 시냅스 전 단백질과 다른 세포 집단의 시냅스 후 리간드의 상호 작용을 증가시켜 결합을 촉진하고 이러한 세포 사이의 이성애성 세포 접착을 매개하며 세포 응집을 유도합니다.

형광 현미경으로 적절한 채널을 사용하여 세포를 이미지화하여 세포의 녹색 및 빨간색 형광을 시각화합니다. 이미지를 처리합니다.

형광 단백질만을 발현하는 세포 집단에서는 응집이 보이지 않습니다. 시냅스 세포 접착 분자를 발현하는 녹색 형광 세포와 적색 형광 세포 사이의 중첩으로 인해 세포 응집은 노란색으로 시각화되어 분자 간의 세포 간 상호 작용을 시사합니다.

HEK293T 세포를 형질감염한 후 48시간 후, 응집을 위해 6웰 플레이트에서 세포를 수확합니다. 먼저 PBS로 각 웰을 두 번 세척합니다. 다음으로, 세포를 부드럽게 분리하려면 각 웰에 1밀리리터의 10밀리몰 EDTA를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다.

양 5분 후, 플레이트를 가볍게 두드려 세포를 분리하고 각 웰을 별도의 15밀리리터 원뿔형 튜브에 수확합니다. 튜브를 실온에서 500 x g으로 5분 동안 원심분리합니다.

세포가 펠릿화되는 동안 미세 원심분리기 튜브의 상단에 실험 조건을 표시하여 6개의 배양 튜브를 준비합니다. GFP와 mCherry의 모든 순열을 사용해야 합니다.

15밀리리터 원뿔형 튜브에서 상청액을 제거하고 세포를 500마이크로리터의 배지에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 각 원뿔형 튜브의 세포를 계산합니다. 그런 다음 각 조건에서 200,000개의 세포를 적절한 배양 튜브에 분취하여 총 부피 500마이크로리터의 일대일 혼합을 수행합니다. 인큐베이션 튜브를 실온에서 느린 튜브 회전기에 넣습니다.

응집을 평가하기 위해 기준선에서, 그리고 60분 후에 다시 배양 튜브에서 40마이크로리터를 하전된 현미경 슬라이드에 피펫팅합니다. 기준선 획득은 미세 원심분리기 튜브에 세포를 추가한 후 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.

녹색 및 빨간색 채널 모두에서 형광 하에서 슬라이드를 이미지화합니다. 각 슬라이드에 대해 하나의 초점면에서 세 가지 다른 시야의 이미지를 캡처합니다.

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Last updated: 18 July 2026