In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

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부된 선충류를 채취하여 생식계열 세포가 노출된 슬라이드에 고정하여 근접 결찰 분석을 시작합니다. 이 세포는 파트너 단백질과 관련된 RNA 결합 단백질(RBP)을 포함하는 높은 수준의 리보핵단백질 복합체를 나타냅니다.

두 개의 특정 표적 단백질(RBP와 파트너 단백질)을 인식하는 두 개의 1차 항체로 슬라이드를 오버레이합니다. 각각의 1차 항체에 특이적인 두 가지 유형의 2차 항체로 슬라이드를 보완합니다.

각 2차 항체는 PLA 프로브(상보적 서열을 가진 DNA 가닥)와 접합됩니다. 2차 항체는 사전 부착된 1차 항체에 결합하여 두 PLA 프로브를 가깝게 만듭니다.

PLA 프로브와 혼성화되는 커넥터 올리고뉴클레오티드를 포함하는 결찰 완충액을 적용하면 리가아제 효소가 간격을 막아 원형 DNA를 생성합니다. 적색 형광단에 부착된 DNA 중합효소, dNTP 및 검출기 프로브를 포함하는 증폭 용액과 함께 슬라이드를 배양합니다.

원형화된 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소는 롤링 서클 증폭을 시작하여 서로 연결된 주형 DNA의 많은 사본을 생성합니다. 증폭된 DNA는 PLA 프로브에 묶인 상태로 유지되어 단백질-단백질 상호 작용 국소화를 가능하게 합니다.

짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 운반하는 검출기 프로브는 증폭된 DNA의 상보적 영역과 상호 작용하여 이중체를 형성하고 단백질 복합체에 형광 신호를 전달합니다. 형광 현미경으로 슬라이드를 이미지

화합니다.

세포 내부에 뚜렷한 붉은 반점이 있는지 관찰하여 성공적인 단백질-단백질 상호 작용을 나타냅니다.

항체 희석제를 사용하여 1차 항체를 희석합니다. 슬라이드에 14 x 14mm 공간당 40마이크로리터의 희석된 1차 항체 용액을 도포합니다. 슬라이드를 습한 챔버에 놓고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

아침에 Coplin 병에 실온에서 50밀리리터의 1x 세척 완충액 A로 슬라이드를 각각 5분 동안 두 번 세척합니다. 60RPM으로 설정된 궤도 셰이커에서 Coplin 병을 설정합니다. 슬라이드를 종이 타월 위에 올려 세척 완충액이 슬라이드에서 흘러내리도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦습니다.

플러스 및 마이너스 프로브가 포함된 40마이크로리터 용액을 준비합니다. 각 14 x 14mm 공간에 용액을 추가합니다. 슬라이드를 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. Coplin 병에 실온에서 50밀리리터의 1x 세척 완충액 A로 슬라이드를 각각 5분 동안 두 번 세