상호 작용 연구를 위한 공동 면역침전된 단백질을 준비하기 위한 막상 단백질 분해

막 내 분해를 수행하려면 파트너 단백질과 관련된 재조합 GFP 태그 표적 단백질을 포함하는 공동 면역침전 단백질 복합체의 용액을 섭취하십시오.

단백질을 미리 습윤된 폴리비닐리덴 디플루오라이드, PVDF 멤브레인이 들어 있는 튜브로 옮기고 배양합니다. PVDF 멤브레인의 친수성 표면은 단백질을 멤브레인으로 전달하는 데 도움이 됩니다.

단백질 함유 멤브레인을 새 튜브로 옮깁니다. 환원제 함유 완충액을 첨가하여 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 감소시켜 상호작용을 방해하지 않고 복합체의 개별 단백질을 변성시킵니다.

이 용액을 복합체에 있는 두 단백질의 설프히드릴기를 알킬화하고 이황화 결합의 재형성을 방지하는 알킬화 시약으로 대체하십시오. 멤브레인을 세척하여 과도한 시약을 제거합니다.

단백질 분해 효소인 트립신을 함유한 완충액으로 막을 처리합니다. 트립신은 아르기닌 및 라이신 잔기의 카르복실 말단에서 GFP 태그가 지정된 표적 단백질과 그 파트너 단백질을 절단하여 더 작은 펩타이드를 상청액으로 방출합니다. 상청액을 새 튜브로 옮깁니다.

산성 용액으로 멤브레인을 세척하여 멤브레인에서 결합된 펩타이드를 해리시켜 완전한 추출을 보장합니다. 펩타이드 함유 분획물을 단일 튜브로 당깁니다. 진공 건조를 통해 건조합니다.

잔기를 저농도의 포름산에 재현탁시켜 단백질-단백질 상호작용 식별을 위한 준비가 된 펩타이드를 용해시킵니다.

멤브레인을 준비하려면 사용 직전에 청소한 수술용 가위를 사용하여 PVDF 멤브레인을 3mm x 3mm 조각으로 자릅니다. 멤브레인 조각을 알루미늄 호일 위에 놓고 각 조각에 2-5마이크로리터의 에탄올을 추가합니다. 멤브레인이 완전히 건조되기 전에 각 조각에 2-5마이크로리터의 단백질 용리액을 첨가하고 멤브레인 표면이 무광택이 될 때까지 자연 건조시킵니다.

그런 다음 멤브레인을 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 섭씨 4도에서 보관합니다. 즉시 사용하는 경우 2-30마이크로리터의 에탄올을 첨가하면 친수성이 됩니다. 피펫으로 에탄올을 제거합니다. 그러나 멤브레인이 건조되기 전에 각 튜브에 200마이크로리터의 DTT 기반 반응 용액을 완전히 추가하고 섭씨 56도에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후 반응 용액을 300마이크로리터의 요오도아세트아미드 용액으로 교체하고 어두운 곳에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 멤브레인을 증류수로 두 번 세척하고 최소 10초 동안 소용돌이치면서 2% 아세토니트릴로 한 번 세척합니다.

디티오스레이톨과 아세토니트릴을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있습니다. 멤브레인 소화 절차를 수행할 때는 항상 마스크, 안경 및 장갑을 착용해야 합니다.

원고 지시에 따라 트립신을 준비하고 각 멤브레인에 100마이크로리터의 트립신 반응 용액을 첨가합니다. 소화를 위해 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

다음날 반응 용액을 깨끗한 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 100마이크로리터의 세척 용액을 멤브레인에 추가합니다. 멤브레인을 섭씨 60도에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 세척된 용액을 모아 반응 용액과 혼합합니다. 멤브레인에 세척 된 용액 100 마이크로 리터를 추가하고 10 분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 세척된 용액을 수집하여 반응 용액과 혼합합니다. 시험관을 실험실 필름으로 덮고 바늘로 필름에 작은 구멍을 뚫습니다.

진공 농축기를 사용하여 용액을 건조시키고 잔류물을 0.2% 포름산 10마이크로리터에 녹입니다. 튜브를 12,000 x g에서 3분 동안 원심분리하고 상청액을 샘플 튜브로 옮깁니다.

나노-LC HPLC 시스템에 연결된 질량 분석기를 사용하여 시료를 분석합니다.