형질주입된 세포에서 효소 수용체 상호작용을 연구하기 위한 면역침전 분석

세포 표면 수용체 단백질인 프로그램된 사멸-1, PD-1은 두 개의 세포질 티로신 모티프, 즉 억제 모티프인 ITIM과 스위치 모티프인 ITSM을 포함합니다. 리간드 결합은 ITIM 및 ITSM 인산화 및 티로신 포스파타제 단백질 SHP2 동원을 PD-1의 세포질 도메인으로 유도하여 다운스트림 신호 전달 캐스케이드를 유발합니다.

공동 면역침전 분석을 통해 SHP2-PD-1 상호작용을 연구하려면 부착 상피 세포 배양을 얻습니다. 이 세포는 녹색 형광 단백질, 인산화된 ITIM 및 ITSM을 가진 GFP 태그 야생형 PD-1을 발현합니다. GFP-태그 돌연변이 PD-1을 발현하는 상피 세포를 얻고, 여기서 ITIM 또는 ITSM 돌연변이는 이들의 인산화를 억제한다.

세

제와 오르토바나데이트 나트륨을 함유한 용해 완충액을 첨가합니다. 세제는 세포를 용해하여 GFP 태그가 붙은 PD-1 단백질 방출을 유발합니다. 오르토바나데이트 나트륨은 포스파타제를 차단하여 ITIM 및 ITSM 탈인산화를 방지합니다.

용해물을 원심분리합니다. 단백질 함유 상청액을 새로운 튜브로 옮깁니다. 항-GFP 항체 코팅 아가로스 비드를 추가합니다. GFP 태그가 부착된 PD-1 단백질은 항-GFP 항체에 결합합니다.

SHP2 현탁액과 함께 배양합니다. 비드 결합 PD-1-GFP는 인산화된 ITIM 및 ITSM을 통해 SHP2에 결합합니다.

Laemmli 완충액을 첨가하고 완충액의 환원제와 세제가 PD-1-GFP-SHP2 단백질 복합체를 변성시키도록 끓입니다. 변성된 단백질 복합체를 포함하는 상청액을 원심분리하고 수집합니다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 수행합니다.

야생형 및 ITIM 돌연변이 PD-1은 SHP2와 상호 작용합니다. ITSM 돌연변이는 SHP2에 결합하지 못하며, 이는 PD1-SHP2 상호 작용에 인산화된 ITSM이 필요함을 나타냅니다.

면역침전을 수행하는 동안 모든 단계는 얼음 위나 섭씨 4도에서 수행해야 합니다. 억제제 1정을 10밀리리터의 완충액에 용해시켜 용해 완충액을 프로테아제 억제제로 보충합니다. 또한 PD1-GFP 형질감염 플레이트에 사용할 완충액에 1밀리몰의 오르토바나드산나트륨을 첨가합니다. 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 세포에 첨가하고, PD1-GFP 형질감염 세포가 포함된 플레이트에만 오르토바나드산나트륨을 함유한 용해 완충액을 추가해야 합니다.

셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를