형질주입된 세포에서 효소 수용체 상호작용을 연구하기 위한 면역침전 분석

세포 표면 수용체 단백질인 프로그램된 사멸-1, PD-1은 두 개의 세포질 티로신 모티프, 즉 억제 모티프인 ITIM과 스위치 모티프인 ITSM을 포함합니다. 리간드 결합은 ITIM 및 ITSM 인산화 및 티로신 포스파타제 단백질 SHP2 동원을 PD-1의 세포질 도메인으로 유도하여 다운스트림 신호 전달 캐스케이드를 유발합니다.

공동 면역침전 분석을 통해 SHP2-PD-1 상호작용을 연구하려면 부착 상피 세포 배양을 얻습니다. 이 세포는 녹색 형광 단백질, 인산화된 ITIM 및 ITSM을 가진 GFP 태그 야생형 PD-1을 발현합니다. GFP-태그 돌연변이 PD-1을 발현하는 상피 세포를 얻고, 여기서 ITIM 또는 ITSM 돌연변이는 이들의 인산화를 억제한다.

제와 오르토바나데이트 나트륨을 함유한 용해 완충액을 첨가합니다. 세제는 세포를 용해하여 GFP 태그가 붙은 PD-1 단백질 방출을 유발합니다. 오르토바나데이트 나트륨은 포스파타제를 차단하여 ITIM 및 ITSM 탈인산화를 방지합니다.

용해물을 원심분리합니다. 단백질 함유 상청액을 새로운 튜브로 옮깁니다. 항-GFP 항체 코팅 아가로스 비드를 추가합니다. GFP 태그가 부착된 PD-1 단백질은 항-GFP 항체에 결합합니다.

SHP2 현탁액과 함께 배양합니다. 비드 결합 PD-1-GFP는 인산화된 ITIM 및 ITSM을 통해 SHP2에 결합합니다.

Laemmli 완충액을 첨가하고 완충액의 환원제와 세제가 PD-1-GFP-SHP2 단백질 복합체를 변성시키도록 끓입니다. 변성된 단백질 복합체를 포함하는 상청액을 원심분리하고 수집합니다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 수행합니다.

야생형 및 ITIM 돌연변이 PD-1은 SHP2와 상호 작용합니다. ITSM 돌연변이는 SHP2에 결합하지 못하며, 이는 PD1-SHP2 상호 작용에 인산화된 ITSM이 필요함을 나타냅니다.

면역침전을 수행하는 동안 모든 단계는 얼음 위나 섭씨 4도에서 수행해야 합니다. 억제제 1정을 10밀리리터의 완충액에 용해시켜 용해 완충액을 프로테아제 억제제로 보충합니다. 또한 PD1-GFP 형질감염 플레이트에 사용할 완충액에 1밀리몰의 오르토바나드산나트륨을 첨가합니다. 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 세포에 첨가하고, PD1-GFP 형질감염 세포가 포함된 플레이트에만 오르토바나드산나트륨을 함유한 용해 완충액을 추가해야 합니다.

셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 즉시 제거하고 수집합니다. 용해물을 1.5밀리리터 콜드 튜브에 옮기고 0.005배 g과 섭씨 4도에서 30분 동안 회전시킵니다. 용해물에서 핵 후 상청액을 수집하려면 10,000배 g 및 섭씨 4도에서 10분 동안

상청액을 새 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 나중에 WCL 분석을 위해 두 번째 6개의 플레이트 세트에 대한 상청액을 얼음 위에 보관합니다.

안티 GFP 비드 준비를 시작하려면 비드가 들어 있는 병을 개봉하기 전에 부드럽게 흔들어 침전을 방지하십시오. 각 조건에 따라 슬러리에서 40마이크로리터의 항-GFP 비드를 제거합니다. 500배g, 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하여 비드를 세척하고, 손실을 방지하기 위해 피펫과 비드 사이의 접촉을 최소화하십시오.

샘플당 80마이크로리터의 용해 완충액에 비드를 재현탁합니다. 세척된 비드를 첫 번째 4개 플레이트 세트의 PD1-GFP 발현 세포의 세포 용해물에 직접 추가합니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 0.005g으로 회전하여 GFP 태그 단백질을 면역침전시킵니다. 각 세척에 대해 오르토바나데이트를 포함하지 않는 1밀리리터의 저온 용해 완충액을 사용하여 비드를 세 번 세척합니다. 그런 다음 2,500배 g에서 10초 동안 원심분리합니다.

첫 번째 플레이트 세트에서 활성 SHP2의 용해물을 세 개의 동일한 부분으로 나누고 세척된 PD1-GFP 함유 비드를 포함하는 3개의 튜브 각각에 일부를 추가합니다. 형질감염되지 않은 세포에서 용해물 부피의 1/3을 야생형 PD1-GFP 비드의 두 번째 튜브에 추가합니다. 나머지 2/3은 버립니다.

드를 섭씨 4도에서 4시간 동안 0.005회 g으로 부드럽게 회전시키면서 배양합니다. 그 후, 각 세척에 대해 1밀리리터의 저온 용해 완충액을 사용하여 비드를 두 번 세척합니다. 각 샘플에 80마이크로리터의 용해 완충액을 추가하여 각 튜브의 총 부피가 100마이크로리터가 되도록 합니다. 자른 피펫 팁을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫을 사용하여 혼합합니다. 그런 다음 각 튜브에서 50마이크로리터를 두 개의 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다.

먼저 비드를 2,000배g, 섭씨 4도에서 30초 동안 회전시키고 상청액을 제거합니다. 20마이크로리터의 2x Laemmli 완충액을 넣고 섭씨 95도에서 5분 동안 끓입니다. BCA 키트를 사용하여 입력 대조군의 단백질 농도를 측정합니다.

가장 희석된 샘플 30마이크로리터를 새 튜브로 옮깁니다. 용해 완충액을 사용하여 나머지 입력 대조군을 가장 희석된 샘플과 동일한 농도로 희석합니다. 그런 다음 희석된 각 입력 컨트롤의 30마이크로리터를 새 튜브로 옮깁니다. 용해물에 같은 부피의 2x Laemmli 완충액을 첨가하고 섭씨 95도에서 5분 동안 끓입니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 전에 2,000배 g 및 섭씨 4도에서 30초 동안 비드를 회전시킵니다.