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생물학적 기술
0 조회수 • 5:20 분 • July 8th, 2025
효모 2-하이브리드 분석의 경우, 전사 활성화제 단백질인 GAL4가 결여된 유전자 조작되고 활발하게 성장하는 효모 세포 현탁액을 사용합니다. 이 세포는 류신과 트립토판을 합성할 수 없습니다.
한쌍의 발현 플라스미드를 추가한다: 하나는 류신과 GAL4의 DNA 결합 도메인인 DNA-BD를 암호화하고, 표적 단백질 도메인의 다른 도메인에 융합된 GAL4의 트립토판과 활성화제 도메인인 AD를 암호화하는 다른 하나는 표적 단백질의 다른 도메인에 융합된다.
형질전환에 적합한 에이전트가 포함된 버퍼를 추가합니다. 세포에 열 충격을 가하여 일시적인 기공 형성을 유발하여 세포 플라스미드 흡수를 촉진합니다. 모공을 다시 밀봉하기 위해 식힙니다. 류신과 트립토판이 없는 선택적 성장 배지에 세포를 도금합니다.
두 개의 하이브리드 단백질을 발현하는 형질전환된 세포는 류신과 트립토판을 합성하고 생존하며 콜로니를 형성합니다.
단백질 도메인에 융합된 DNA-BD는 β-갈락토시다아제-암호화 유전자 프로모터 영역의 특정 업스트림 DNA 서열에 결합합니다. 표적 단백질 도메인이 상호 작용하면 AD와 DNA-BD가 더 가까워져 기능적 GAL4의 재구성을 일으켜 β-갈락토시다제 유전자의 발현을 유도합니다.
콜로니를 여과지에 옮깁니다. 세포를 동결-해동하여 용해하고 β-갈락토시다아제를 방출합니다. 이 여과지를 β-갈락토시다제 기질에 적신 다른 여과지 위에 놓습니다.
방출된 β-갈락토시다아제는 기질을 갈락토스와 불안정한 생성물로 가수분해하며, 이는 이량체화되고 산화되어 여과지에 파란색 침전물을 형성하여 표적 단백질 도메인 상호 작용을 나타냅니다.
이 효모 2-하이브리드 분석에서는 중간 로그 단계의 효모 세포가 형질전환에 사용됩니다. 원심분리로 세포를 수확합니다. 각 펠릿을 멸균수 5밀리리터에 재현탁하고 세포 현탁액을 모으십시오. 세포 현탁액을 원심분리합니다.
상청액을 버린 후, 효모 펠릿을 새로 준비된 멸균 1X 리튬 아세테이트 및 TE 1밀리리터에 재현탁합니다. 유능한 효모 세포는 준비 후 1시간 이내에 사용해야 합니다. 미끼 및 표적 플라스미드 DNA를 100마이크로그램의 청어 고환 운반체 DNA와 혼합하여 플라스미드 샘플을 준비합니다.
각 1.5밀리리터 튜브에 100마이크로리터의 유능한 효모 현탁액과 600마이크로리터의 1X 리튬 아세테이트 및 PEG 용액을 넣고 약 30초 동안 소용돌이치게 합니다. 섭씨 30도에서 30분 동안 쉐이크하면서
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