단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

탠덤 친화성 정제는 단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위해 세포에서 단백질 복합체를 분리하기 위한 순차적 정제 방식입니다.

시작하려면 관심 있는 에피토프 태그 단백질을 발현하는 세포 배양을 취하십시오. 단백질은 세포 내부에서 복합체를 형성합니다. 복합체의 단백질 중 하나에는 Strep-tag가 포함되어 있고 다른 하나는 FLAG-tag로 표시되어 있습니다. 이들은 작은 합성 펩타이드 서열 기반 친화성 태그입니다.

배지를 제거하고 세제 용액을 첨가하여 세포를 용해시킵니다. 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 표적 단백질 복합체 및 기타 세포 단백질을 포함하는 상청액을 수집합니다.

스트렙타비딘으로 코팅된 아가로스 구슬인 연쇄상 구슬을 넣고 배양합니다. 단백질 복합체의 Strep-tag는 스트렙타비딘에 결합합니다. 원심분리하여 단백질 복합체 결합 비드를 수집합니다. 오염된 세포 단백질을 제거하기 위해 세척하십시오.

스트렙타비딘에 경쟁적으로 결합하여 단백질 복합체를 대체하는 비오틴 유도체인 데스티오비오틴을 함유한 용출 완충액을 추가합니다. 용출된 단백질 복합체를 포함하는 상청액을 얻기 위해 원심분리합니다.

항-FLAG 항체로 코팅된 아가로스 비드인 FLAG-비드를 추가하고 배양합니다. 단백질 복합체의 FLAG 태그는 항체에 결합합니다. 원심분리하여 단백질 복합체 결합 비드를 수집합니다.

유리 FLAG 펩타이드를 함유한 용출 완충액을 첨가합니다. 펩타이드는 항체에 경쟁적으로 결합하고 결합된 단백질 복합체를 대체합니다. 정제된 단백질 복합체를 용리하기 위해 원심분리합니다.

리액에 두 단백질의 존재를 평가하여 관심 단백질 간의 상호 작용을 확인합니다.

세포 용해물과 STREP-비드 슬러리 혼합물을 2시간 동안 배양한 후, 섭씨 4도에서 2분 동안 1,1500배g으로 회전시킵니다. 상청액을 "STREP AP flow-through"로 저장하고 섭씨 4도에서 보관합니다.

500마이크로리터의 STREP AP 세척 완충액 1을 비드에 첨가합니다. 비드와 완충액 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 분동시키고, 섭씨 4도에서 2분 동안 1,500배g으로 원심분리한다. 상청액을 버리고 500마이크로리터의 STREP AP 세척 완충액 1로 다시 세척합니다.

세 번째 세척 후 비드 용액을 새로운 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮겨 단백질 배경을 줄입니다. STREP AP 세척 완충액 1로 네 번째 세척합니다. 탈수 후 상층액을 제거하고 500마이크로리터의 세척 완충액 2를 추가합니다.

튜브를 뒤집어 비드를 평형화한 다음 섭씨 4도에서 2분 동안 1,500배g으로 회전시킵니다. 상청액을 버리십시오. 50마이크로리터의 STREP 용출 완충액으로 관심 단백질을 용리합니다. 섭씨 800도에서 15분 동안 4RPM의 소용돌이. 비드를 섭씨 4도에서 1분간 1500배 g으로 회전시킵니다. 상청액을 수집합니다. 이 분획은 "STREP AP 용출" 샘플에 해당합니다.

두 번째 용출을 위해 비드 분획을 섭씨 4도에서 보관합니다. 은 염색 및/또는 웨스턴 블로팅을 위해 STREP AP 용출액의 10%를 분취합니다.

후속 FLAG 면역침전을 위한 출발 물질의 양을 늘리기 위해 첫 번째 및 두 번째 STREP 용출을 함께 풀링하여 FLAG 용출을 보다 효율적으로 회수할 수 있습니다.

입이 넓은 피펫 팁을 사용하여 적절한 양의 FLAG 비드 용액을 미세 원심분리기 튜브로 옮기는 것으로 이 절차를 시작합니다. 섭씨 4도에서 2분 동안 1,500배 g으로 회전시킵니다. 상청액을 제거하고 500마이크로리터의 FLAG 세척 완충액을 비드에 첨가합니다.

씨 4도에서 2분 동안 1,500배 g으로 회전시킵니다. 상청액을 버리고 FLAG 세척 완충액으로 다시 세척합니다. 세 번째 세척 후, 상청액을 제거하고 비드를 FLAG 세척 완충액에 n곱하기 16마이크로리터의 최종 부피로 재현탁합니다. 여기서 n은 샘플 수입니다.

나머지 STREP AP 용출액에 16마이크로리터의 FLAG 비드 슬러리를 첨가하고 섭씨 4도에서 밤새 장동화합니다. FLAG 비드 슬러리 및 STREP AP 용출을 하룻밤 배양한 후 FLAG 면역침전을 진행합니다.

FLAG 비드 현탁액을 섭씨 4도에서 2분 동안 1,500배 g으로 회전시킵니다. 상청액을 "FLAG IP 플로우 스루"로 저장하고 섭씨 4도에서 보관합니다.

500마이크로리터의 FLAG 세척 완충액을 비드에 첨가합니다. 섭씨 4도에서 5분간 장동하고, 섭씨 4도에서 2분간 1,500배g으로 원심분리한다. 상청액을 버리고 500마이크로리터의 FLAG 세척 완충액으로 다시 세척합니다.

세 번째 세척 후 단백질 비드 용액을 새로운 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮겨 배경을 줄입니다. FLAG 세척 완충액으로 네 번째 세척하십시오. 최종 스핀에서 상청액을 제거하고 FLAG 펩타이드 마이크로리터당 200나노그램을 포함하는 30마이크로리터의 FLAG 세척 완충액을 비드에 추가합니다. 섭씨 4도에서 2시간 동안 800RPM의 소용돌이.

2시간 후, 현탁액을 섭씨 4도에서 2분 동안 1,500배 g으로 회전시킵니다. 상청액을 수확하고 "FLAG IP 용출"로 섭씨 4도에서 보관합니다.