0 조회수 • 6:05 분 • July 8th, 2025
핵 자기 공명(NMR) 분광법은 원자 수준의 단백질-단백질 상호 작용 검출을 가능하게 합니다.
구형 단백질과 나선형 단백질 사이의 상호 작용을 연구하려면 정제된 야생형 또는 돌연변이 구형 단백질을 질소 동위원소인 15N으로 라벨링합니다. NMR 튜브에서 NMR 표준물질이 포함된 용매에 표지된 구형 단백질과 표지되지 않은 나선형 단백질을 혼합합니다. 튜브를 NMR 분광계에 삽입합니다.
분광계 자석은 강한 자기장을 생성하여 15개의 N-표지된 구형 단백질 핵을 자기장과 평행하게 정렬합니다. 고주파 또는 RF 펄스는 15개의 N-핵을 여기시켜 필드에 반대 평행하게 정렬합니다.
두 상태 사이의 15N핵의 전이에 필요한 펄스 주파수는 공진 주파수를 정의합니다. 15N공명 주파수를 NMR 표준으로 정규화하면 15N화학적 이동이 측정됩니다.
자기장은 15N에 결합된 1H-핵을 필드와 평행하게 정렬하도록 조정됩니다. RF 펄스가 조정되고 1H-화학 이동이 기록됩니다.
단백질 상호 작용 동안 상호 작용하는 아미노산 잔기를 둘러싼 화학적 환경이 변화하여 15개의 N-1H화학 결합과 그에 상응하는 화학적 이동이 변경됩니다. 15 N-1H NMR 스펙트럼을 그립니다.
나선형 단백질이 없으면 야생형 구형 단백질은 잘 분해된 스펙트럼 피크를 나타냅니다. 나선형 및 야생형 구형 단백질이 상호 작용하면 스펙트럼 피크가 감소합니다. 대조적으로, 나선형 단백질을 돌연변이 구형 단백질과 함께 배양하면 스펙트럼 피크가 다시 나타나 이들 사이에 상호 작용이 없음을 나타냅니다.
꺼내기 명령 "ej"로 공기 흐름을 켭니다. 이렇게 하면 자석에서 샘플이 올라옵니다. 이제 개구부의 자석 위에 있는 스피너 안에 샘플을 놓습니다. "ij" 명령으로 삽입합니다. 계속하기 전에 샘플이 자석 내부에 가라앉을 때까지 기다리십시오.
"edc" 명령을 사용하여 새 데이터 세트를 생성하고 실험 "ZGPR"을 선택하여 표준 양성자 NMR 매개변수를 로드합니다. 이름, 실험 번호 및 처리된 데이터 폴더 번호 필드를 입력합니다.
"Set Solvent" 필드에서 용매를 선택하고 "Execute 'getprosol'"을 클릭하여 표준 프로브 헤드 및 용매 종속 매개변수를 읽습니다. "잠금" 명령을 사용하여 샘플을 중수소화 용매에 잠그고 스위핑이 완료되고 잠금이 될 때까지 기다립니다.
자동 튜닝 명령 "atma"를 사용하여 샘플을 튜닝하여 자석의 공진 주파수를 수정합니다. 자동 튜닝이 완료될 때까지 워블 곡선을 모니터링합니다.
"TOPSHIM"을 사용하여 자기장을 심싱합니다. 시밍은 자기장을 조정하여 샘플 주변의 균일성을 달성합니다. "wsh" 명령으로 동일한 값을 저장하고 동일하거나 유사한 샘플을 사용하는 경우 topshim 전에 "rsh"를 사용하여 읽는 것이 좋습니다.
이제 "rga" 명령으로 수신기 게인을 조정하여 최대 신호 대 잡음비를 달성합니다. 스펙트럼의 중심을 물 공명 오프셋에 놓고 "calibo1p1"을 사용하여 90도 양성자 펄스를 고출력으로 설정합니다.
Zero Go "zg" 명령을 사용하여 양성자 스펙트럼을 수집하고 "efp"로 처리합니다. 여기에는 지수 곱셈, 선 확장을 통합한 자유 유도 감쇠, FID의 푸리에 변환 및 위상 보정을 적용하기 위한 "pk"가 포함됩니다.
적분 옵션이 없는 다항식을 사용하여 자동 위상 보정 "apk"와 자동 기준선 보정 "absn"을 적용합니다. 실험에서 "SFHMQC3GPPH"을 선택하여 SOFAST HMBC 실험을 위한 새 데이터 세트를 만듭니다.
양성자 스펙트럼에서 최적화된 P1 및 O1을 복사하고 "getprosol 1H p1 plw1" 명령을 사용하여 P1 종속 펄스를 채웁니다. 여기서 P1은 최적화된 P1 값이고 plw1은 P1의 전력 레벨입니다. 이제 CNST54 상수를 최적화하여 아미드 화학 물질 이동에 대한 오프셋을 설정합니다. 또한 CNST55를 최적화하여 관심 스펙트럼 영역을 포괄하기 위해 대역폭을 정의하여 수신기 이득을 최적화할 수 있습니다.
이러한 매개변수를 선택하려면 2차원 스펙트럼에서 첫 번째 FID를 추출하고 관측된 신호를 찾아 정의합니다. 또한 완화 지연, 스캔 횟수 및 더미 스캔을 변경하여 "gs" 명령을 사용하여 허용 가능한 신호 감도를 얻을 수 있으며, 이를 통해 go 및 scan이 실시간으로 데이터 품질을 모니터링할 수 있습니다. 마지막으로 Zero Go "zg"를 사용하여 스펙트럼을 기록합니다.