Phage Display를 사용하여 타겟 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질 선택

표적 단백질로 코팅된 멀티웰 플레이트의 웰에 파지 라이브러리를 추가하여 파지 디스플레이를 시작합니다. 파지 라이브러리에는 유전자 조작된 파지가 포함되어 있으며, 각 파지는 표면의 코트 단백질에 융합된 개별 단백질 변이를 나타냅니다. 파지와 표적 단백질이 상호 작용할 수 있도록 배양합니다.

표적 단백질 친화도가 높은 단백질을 가진 파지는 표적 단백질에 결합합니다. 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 파지를 제거합니다. 산성 용액을 첨가하여 파지와 표적 단백질의 상호작용을 방해하고 파지를 용액으로 방출합니다. 완충액을 사용하여 용액 pH를 중화하여 파지 안정성을 유지합니다.

파지를 새 튜브로 옮깁니다. 단백질을 함유한 차단 용액과 함께 배양하여 비특이적 상호 작용을 방지합니다.

파지를 능동적으로 분열하는 대장균 현탁액으로 옮겨 박테리아를 감염시키고 파지 복제 주기를 시작합니다. 박테리아를 감염시키는 도우미 파지로 보충하여 자손 파지를 포장하는 데 필요한 코트 단백질을 제공합니다. 현탁액을 선택적 배지로 옮겨 파지에 감염된 박테리아가 성장할 수 있도록 합니다.

자손 파지는 결국 배지로 방출됩니다. 원심 분리기. 파지를 함유한 상청액을 수집합니다. 침전 용액을 추가하여 파지 입자를 농축합니다. 원심 분리기. 파지 펠릿을 완충액에 재현탁하여 균질한 현탁액을 얻습니다.

후속 파지 선택 라운드를 수행하고, 파지-표적 단백질 결합, 증가된 완충액 세척 엄격성 단계로 용출, 증폭 및 원심분리 단계를 반복하여 표적 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질을 나타내는 파지 풀을 농축시킵니다.

얼음 위에서 파지 라이브러리를 해동합니다. 그런 다음 PBS에서 라이브러리 다양성의 100배로 희석합니다. 희석된 라이브러리 부피의 1/5에 폴리에틸렌 글리콜/염화나트륨 용액을 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 용액을 섭씨 4도에서 30분 동안 11,000배 g으로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 2분 더 원심분리하여 남은 상층액을 끌어내리고 파지 펠릿을 농축합니다.

분석할 표적 단백질당 1밀리리터의 PBT 완충액에 파지 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다(일반적으로 총 4개). 100마이크로리터의 파지 라이브러리를 대조군 플레이트의 코팅된 각 웰에 추가합니다. 실온에서 300RPM 궤도 흔들면서 한 시간 동안 배양합니다.

대상 플레이트의 PB 완충액을 싱크대로 버리고 종이 타월로 플레이트를 말립니다. 대조군 플레이트에 있는 파지 라