Phage Display를 사용하여 타겟 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질 선택

표적 단백질로 코팅된 멀티웰 플레이트의 웰에 파지 라이브러리를 추가하여 파지 디스플레이를 시작합니다. 파지 라이브러리에는 유전자 조작된 파지가 포함되어 있으며, 각 파지는 표면의 코트 단백질에 융합된 개별 단백질 변이를 나타냅니다. 파지와 표적 단백질이 상호 작용할 수 있도록 배양합니다.

표적 단백질 친화도가 높은 단백질을 가진 파지는 표적 단백질에 결합합니다. 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 파지를 제거합니다. 산성 용액을 첨가하여 파지와 표적 단백질의 상호작용을 방해하고 파지를 용액으로 방출합니다. 완충액을 사용하여 용액 pH를 중화하여 파지 안정성을 유지합니다.

파지를 새 튜브로 옮깁니다. 단백질을 함유한 차단 용액과 함께 배양하여 비특이적 상호 작용을 방지합니다.

파지를 능동적으로 분열하는 대장균 현탁액으로 옮겨 박테리아를 감염시키고 파지 복제 주기를 시작합니다. 박테리아를 감염시키는 도우미 파지로 보충하여 자손 파지를 포장하는 데 필요한 코트 단백질을 제공합니다. 현탁액을 선택적 배지로 옮겨 파지에 감염된 박테리아가 성장할 수 있도록 합니다.

자손 파지는 결국 배지로 방출됩니다. 원심 분리기. 파지를 함유한 상청액을 수집합니다. 침전 용액을 추가하여 파지 입자를 농축합니다. 원심 분리기. 파지 펠릿을 완충액에 재현탁하여 균질한 현탁액을 얻습니다.

후속 파지 선택 라운드를 수행하고, 파지-표적 단백질 결합, 증가된 완충액 세척 엄격성 단계로 용출, 증폭 및 원심분리 단계를 반복하여 표적 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질을 나타내는 파지 풀을 농축시킵니다.

얼음 위에서 파지 라이브러리를 해동합니다. 그런 다음 PBS에서 라이브러리 다양성의 100배로 희석합니다. 희석된 라이브러리 부피의 1/5에 폴리에틸렌 글리콜/염화나트륨 용액을 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 용액을 섭씨 4도에서 30분 동안 11,000배 g으로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 2분 더 원심분리하여 남은 상층액을 끌어내리고 파지 펠릿을 농축합니다.

분석할 표적 단백질당 1밀리리터의 PBT 완충액에 파지 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다(일반적으로 총 4개). 100마이크로리터의 파지 라이브러리를 대조군 플레이트의 코팅된 각 웰에 추가합니다. 실온에서 300RPM 궤도 흔들면서 한 시간 동안 배양합니다.

대상 플레이트의 PB 완충액을 싱크대로 버리고 종이 타월로 플레이트를 말립니다. 대조군 플레이트에 있는 파지 라이브러리의 100마이크로리터를 모두 표적 플레이트의 코팅된 각 웰로 옮깁니다. 실온에서 300RPM 궤도 흔들면서 한 시간 동안 배양합니다.

다음으로, 플레이트에서 파지 라이브러리를 제거하고 코팅된 웰을 PT 완충액으로 4회 세척합니다. 접시를 뒤집고 종이 타월을 두드려 마지막 완충액을 제거합니다. 코팅된 각 웰에 100마이크로리터의 0.1몰염산을 첨가하여 파지를 용리합니다. 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양하고 300RPM 궤도 흔들기와 함께 합니다.

그 후, 12.5마이크로리터의 pH 11 1몰 트리스 염산염을 코팅된 각 웰에 첨가하여 pH를 중화합니다. 8개의 웰 모두에서 용출된 파지를 단일 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이송 중에 위아래로 피펫을 사용하여 용액을 균질하게 만들고 웰에서 모든 액체를 흡인합니다. 용출된 파지에 10% BSA를 첨가하여 최종 농도를 1%로 만듭니다.

미세 원심분리기 튜브를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이것은 라운드 1 출력입니다. 한천 플레이트에서 분리된 대장균 콜로니를 5밀리리터의 2YT/테트라사이클린 종자 배양액을 접종하여 다음 선택을 위해 파지 입력을 배양하기 위한 종자 배양을 준비합니다.

섭씨 37도에서 200RPM 궤도 흔들림으로 밤새 배양합니다. 라운드 2 및 3 튜브의 표적 단백질을 적절한 양의 PBS로 희석합니다. 라운드 2 및 3 튜브 내용물의 절반을 취하고 다음 라운드를 위해 96웰 결합 플레이트에 표적 단백질당 4개의 웰을 코팅합니다.

다음으로, 라운드 1 출력의 절반을 사용하여 3밀리리터의 중간 로그상 세포를 접종합니다. 섭씨 37도에서 30RPM 궤도 흔들면서 200분 동안 배양합니다. M13KO7 헬퍼 파지를 밀리리터당 100억 pfu의 최종 농도로 첨가합니다. 섭씨 37도에서 200RPM 궤도 흔들면서 한 시간 동안 다시 배양합니다.

한 시간 후, 배양액 3밀리리터 전체를 2YT/카르베니실린/카나마이신 용액 30밀리리터에 옮깁니다. 섭씨 37도에서 밤새 성장하여 200RPM 궤도 흔들림으로 성장합니다.