게놈 DNA의 표적 단백질 결합 부위를 확인하기 위한 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)

DNA에서 표적 단백질의 결합 부위를 식별하려면 염색질의 특정 DNA 서열에 가교된 표적 단백질을 포함하는 희소돌기아교세포 전구체 세포로 시작합니다.

프로테아제 억제제를 함유한 용해 완충액으로 세포를 처리합니다. 용해 완충액은 세포를 용해시키는 반면, 억제제는 단백질-염색질 복합체의 무결성을 유지하기 위해 프로테아제를 비활성화합니다.

내용물을 초음파 처리하여 복합체를 더 작은 염색질 단편으로 전단하고 일부는 표적 단백질을 유지합니다.

원심분리하여 세포 성분을 펠릿화하고 염색질 단편을 포함하는 상청액을 신선한 튜브로 옮깁니다. 염색질 단편의 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항표적 항체와 함께 배양합니다.

사전 결합된 항체의 Fc 영역에 결합하는 단백질 A 코팅 마그네틱 비드로 튜브를 보충합니다. 자기장을 적용하여 염색질 단편과 복합체화된 항체 결합 표적 단백질을 선택적으로 침전시킵니다.

비드 복합체를 고염 함유 용출 완충액으로 처리하여 단백질-염색질 상호작용을 방해하고 관련 단백질 없이 벌거벗은 DNA를 방출합니다.

유기 용매를 사용하여 DNA를 추출합니다. 증폭 완충액을 추가하고 중합효소 연쇄 반응을 실행하여 DNA 단편을 증폭합니다. 증폭 후 DNA 서열을 분석합니다.

증폭된 산물의 서열을 세포의 게놈 DNA 서열과 비교합니다. 단편과 게놈 DNA 사이의 서열 일치가 있는 영역을 찾아 단백질 결합 부위와 상관관계가 있습니다.

혈구계에서 계수한 후, ChIP 반응을 위해 OPC 세포 배양 배지 1밀리리터에 정제된 OPC 20,000개를 첨가합니다. 그런 다음 27마이크로리터의 36.5% 포름알데히드를 실온에서 10분 동안 첨가합니다. 이렇게 하면 세포가 수정됩니다.

10분 후, 고정 세포에 50마이크로리터의 2.5몰 글리신을 실온에서 5분 동안 첨가합니다. 글리신을 첨가하면 DNA-단백질 가교가 중단됩니다. 그런 다음 가교 세포를 프로테아제 억제제 칵테일이 포함된 HBSS 완충액 1밀리리터로 세척합니다. 다음으로, 예냉된 원심분리기에서 세포를 섭씨 4도에서 300배g으로 원심 분리합니다.

정제된 OPC를 가교한 후, 가교된 세포는 얼음처럼 차가운 HBSS 용액을 사용하여 세척하고 나머지 ChIP 단계는 4도에서 수행해야 합니다. 그렇지 않으면 항체가 게놈 DNA를 제대로 침전시킬 수 없습니다.

그런 다음 25마이크로리터의 완전 용해 완충액을 세포 펠릿에 첨가하고 얼음 위에 5분 동안 둡니다. 다음으로, 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 얼음처럼 차가운 HBSS 완충액 75마이크로리터를 피펫팅합니다. 그런 다음 30초 ON 및 30초 OFF 프로그램의 5주기로 예식된 초음파 처리 시스템에서 세포 용해물의 염색질을 전단합니다.

염색질이 전단되면 세포 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 14,000배 g으로 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 수집합니다. 그런 다음 전단된 염색질 100마이크로리터를 프로테아제 억제제가 포함된 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 ChIP 완충액으로 희석합니다.

다음으로, 희석된 전단 염색질 180마이크로리터에 토끼 항올리그2 항체 1마이크로리터를 첨가합니다. 회전하는 휠에서 분당 40회전으로 섭씨 4도에서 16시간 동안 튜브를 배양합니다. 다음으로, 10마이크로리터의 사전 세척된 단백질 A 코팅 비드를 냉장실의 ChIP 반응 튜브에 추가합니다. 다시 ChIP 튜브를 회전하는 휠에서 섭씨 4도에서 2시간 더 배양합니다.

2시간 후 ChIP 반응 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 회전하는 휠에서 각각 4분 동안 4개의 세척 완충액 100마이크로리터로 비드 펠릿을 세척합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 용출 완충액을 비드 펠릿에 추가합니다. 반응 튜브를 섭씨 65도에서 4시간 동안 배양합니다.

이중 가닥 DNA가 변성되면 새우 알칼리성 포스파타제를 첨가하여 단일 가닥 DNA의 3-프라임 말단을 탈인산화합니다. 그런 다음 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 사용하여 단일 가닥 DNA에 폴리(T) 꼬리를 추가합니다. 다음으로, DNA 폴리(dA) 프라이머를 단일 가닥 DNA 주형에 어닐링합니다. 다음으로, 인덱싱을 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 ChIP 서열 라이브러리를 증폭합니다.

라이브러리 준비를 위한 PCR 주기 수는 시작 DNA의 양에 따라 다릅니다. 좋은 라이브러리 준비를 위해서는 입력 DNA 양의 정확한 정량화가 필요합니다. PCR 주기가 너무 많거나 너무 적으면 라이브러리 농도와 복잡성에 영향을 미쳐 PCR 아티팩트가 발생할 수 있습니다.

상자성 비드를 사용하여 PCR 증폭 ChIP 서열 라이브러리에서 250에서 500 염기쌍 범위의 단편을 선택합니다. 미세유체 ChIP 모세관 전기영동 장치를 사용하여 선택한 ChIP 서열 라이브러리의 품질을 검사합니다.