0 조회수 • 4:25 분 • July 8th, 2025
RNA 결합 단백질인 RBP는 mRNA의 번역 개시 영역인 TIR에 결합하고 번역을 억제함으로써 전사 후 조절자로 기능합니다.
리포터 유전자의 번역 억제를 통한 RNA-RBP 상호작용을 연구하려면 두 개의 플라스미드(결합 부위와 RBP 플라스미드)를 포함하는 박테리아 세포 배양을 취하십시오.
결합 부위 플라스미드는 형광 리포터 유전자를 암호화합니다. 전사 시 생성된 mRNA의 TIR에는 RBP에 의해 인식되는 서열과 함께 리보솜 결합 부위와 헤어핀 구조가 포함됩니다.
리보솜은 mRNA의 결합 부위에 결합하여 헤어핀 구조를 불안정하게 하여 mRNA 번역 및 형광 리포터 단백질 형성을 유도합니다. RBP 플라스미드는 다른 형광 단백질에 융합된 키메라 RBP를 발현합니다. 유도성 프로모터는 키메라 단백질 발현을 제어합니다.
프로모터에 결합하는 전사 인자를 활성화하여 키메라 단백질 발현을 유도하는 유도제를 추가합니다. 키메라 단백질의 RBP는 헤어핀 구조에 결합합니다. 이는 리보솜이 mRNA에 결합하는 것을 차단하여 리포터 단백질 번역을 억제합니다.
유도제 농도가 증가함에 따라 RBP 생산이 증가하여 mRNA에 대한 리보솜 결합에 대한 경쟁적 억제가 더 강해집니다.
키메라 단백질과 리포터 단백질의 다양한 형광 신호를 측정합니다. 신호를 플로팅하여 용량-반응 곡선을 얻습니다.
RBP 생산의 유도제 매개 증가와 함께 번역 억제는 리포터 단백질 농도를 감소시켜 RNA-RBP 상호작용을 확인합니다.
준비된 플라스미드를 이미 RBP-mCerulean 플라스미드를 포함하는 화학적으로 유능한 박테리아 세포로 변환합니다. 시간을 절약하려면 관련 항생제가 포함된 Luria-Bertani 한천이 포함된 8레인 플레이트에 8채널 피펫터를 사용하여 세포를 플레이트합니다. 콜로니는 섭씨 37도에서 16시간 안에 나타나야 합니다.
각 이중 형질전환체에 대해 단일 콜로니를 선택하고 적절한 항생제와 함께 1.5밀리리터의 LB를 포함하는 48웰 플레이트로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 250RPM으로 흔들면서 18시간 동안 세포를 성장시킵니다. 하룻밤 동안의 글리세롤 스톡을 섭씨 -80도에서 96웰 플레이트에 보관합니다.
아침에 96웰 플레이트에 180마이크로리터의 준가난한 배지(SPM)를 데우도록 로봇을 프로그래밍합니다. 인덕서 플레이트를 준비하도록 로봇을 프로그래밍합니다.
깨끗한 96웰 플레이트에서 95% BA 및 5% LB로 구성된 SPM으로 웰을 준비합니다. 웰의 수는 원하는 유도제 농도 수에 해당합니다. 가장 높은 유도제 농도를 포함할 유도제 플레이트의 웰에 C4-HSL을 추가합니다.
다음으로, 각각의 최고 농도 웰에서 매질을 0에서 218나노몰 범위의 23개의 낮은 농도로 연속적으로 희석하도록 로봇을 프로그래밍합니다. 각 유도제 희석액의 부피는 모든 균주에 충분해야 합니다.
하룻밤 균주를 희석하려면 48웰 플레이트에서 20마이크로리터의 박테리아와 180마이크로리터의 SPM을 혼합하여 10배로 희석하도록 로봇을 프로그래밍합니다. 그런 다음 희석된 용액에서 20마이크로리터를 형광 측정에 적합한 미리 준비된 스트레인 플레이트로 가져와 다시 10배로 희석합니다.
이제 최종 농도에 따라 희석된 균주가 있는 96웰 플레이트에 인덕서 플레이트에서 희석된 인듀서를 추가하도록 로봇을 프로그래밍합니다. 96웰 플레이트를 섭씨 37도에서 6시간 동안 흔듭니다. 이 시간 동안 595나노미터에서 광학 밀도 또는 OD를 측정하고 30분마다 플레이트 리더를 통해 mCherry 및 mCerulean 형광을 측정합니다.