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생물학적 기술
0 조회수 • 4:12 분 • July 8th, 2025
변형된 효모 단일 하이브리드 분석을 사용하여 여러 단백질과 표적 DNA를 포함하는 이종 단백질 복합체 간의 상호 작용을 검출하려면 활발하게 성장하고 형질전환된 효모 세포 배양의 원하는 농도가 포함된 멀티웰 플레이트를 사용합니다.
이 세포는 GAL-4 프로모터에 의해 구동되는 리포터 β-갈락토시다제 암호화 유전자의 상류에 특정 DNA 서열을 포함하지만 내인성 GAL-4 전사 인자 단백질은 부족합니다. 세포는 GAL-4 활성화 도메인에 융합된 표적 단백질과 GAL-4 DNA 결합 도메인이 없는 또 다른 단백질을 발현합니다.
이러한 단백질이 상호 작용하면 복합체를 형성하여 표적 단백질이 리포터 유전자의 프로모터 영역에 있는 업스트림 DNA 서열에 결합할 수 있습니다. GAL-4 활성화 도메인은 리포터 β-갈락토시다제 효소 발현을 활성화합니다.
원심 분리기. 세포를 적절한 완충액에 재현탁합니다. 세포를 동결-해동하여 용해하고 β-갈락토시다아제를 방출합니다. 베타-메르캅토에탄올과 β-갈락토시다제 기질 함유 완충액을 첨가합니다.
베타-메르캅토에탄올은 β-갈락토시다아제 효소를 안정화시킵니다. β-갈락토시다아제는 β-갈락토시다아제 기질을 가수분해하여 노란색 발색원을 형성합니다.
탄산나트륨 용액을 첨가하여 β-갈락토시다아제를 변성시키고 반응을 중지합니다. 원심 분리기. 노란색 발색원을 함유한 상청액을 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 리더를 사용하여 적절한 파장에서 용액의 광학 밀도를 측정하여 β-갈락토시다제 활성을 계산합니다.
β-갈락토시다제 활성이 높을수록 단백질과 표적 DNA 서열 사이의 긍정적인 상호 작용을 나타내며, 이는 β-갈락토시다제 발현으로 이어집니다.
배양액을 재현탁하고 각 웰에서 125마이크로리터를 분광 광도계 플레이트로 옮깁니다. 600나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 0.3에서 0.6 사이인지 확인합니다. 딥 웰 블록의 나머지 세포를 3,000배 g 및 섭씨 21도에서 10분 동안 원심분리합니다. 반전시켜 상청액을 제거합니다.
각 웰과 와류에 200마이크로리터의 Z-버퍼를 추가합니다. 3,000배 g, 섭씨 21도에서 5분 동안 원심분리합니다. 반전시켜 상청액을 제거합니다. 각 웰과 와류에 20마이크로리터의 Z-버퍼를 추가합니다. 동결-해동 주기에 강한 밀봉 호일로 플레이트를 덮습니다.
흄 후드에서 섭씨 42도 수조에서 액체 질소를 사용하여 4주기의 동결-해동을 수행합니다. 새로 준비된 Z-완충액/베타-메르캅토에탄올/ONPG 용액 200마이크로리터를 각 웰에 첨가합니다. 섭씨 30도에서 17-24시간 동안 또는 색이 나타날 때까지 배양합니다. 색상이 발현했는지 확인하십시오.
반응을 멈추기 위해 각 웰에 110마이크로리터의 1몰 탄산나트륨을 첨가합니다. 시간을 기록하고 접시를 소용돌이치십시오. 3,000배g, 섭씨 21도에서 10분 동안 원심분리합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 분광 광도계 플레이트로 125마이크로리터의 상청액을 옮깁니다. 420나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다.