0 조회수 • 4:10 분 • July 8th, 2025
RNA 헬리카제 활성을 가진 단백질은 RNA 이중체에서 개별 RNA 분자를 풀고 분리하는 데 도움이 될 수 있습니다.
단백질의 헬리카제 활성을 결정하려면 비오틴 표지 RNA 이중체와 5'-오버행, ATP 및 RNA 트랩(이중 체의 비오티닐화 가닥을 보완하는 표지되지 않은 가닥)의 혼합물이 포함된 튜브를 사용합니다.
헬리카제 활성이 있는 단백질을 각 튜브에 추가하고 서로 다른 기간 동안 배양합니다. 단백질은 이중 세포의 5'-돌출부에 결합합니다.
ATP 분자를 사용하여 두 이중 가닥 사이의 수소 결합을 끊어 비오티닐화된 단일 가닥 RNA를 풀고 방출합니다. RNA 트랩은 비오틴 표지 가닥과 상호 작용하여 분리된 가닥과의 재어닐링을 방지합니다.
종단 완충액을 사용하여 반응을 종료합니다.
천연 폴리아크릴아미드 겔의 다른 웰에 샘플을 로드합니다. 전기영동을 실행합니다. 저분자량, 단일 가닥 RNA는 고분자량 이중체보다 빠르게 움직입니다. 이러한 이동성 변화는 두 개의 서로 다른 대역을 생성합니다.
나일론 멤브레인에 젤을 블롯하여 RNA를 멤브레인으로 옮깁니다. 블로팅 후 멤브레인을 UV 광선에 노출시켜 RNA를 멤브레인에 가교합니다.
이중체 및 단일 가닥의 비오틴과 상호 작용하는 화학발광 효소 접합 스트렙타비딘을 첨가합니다. 화학발광 기판을 사용하여 화학발광 제품을 생산합니다.
이미징 시 저분자량 밴드의 강도는 시간이 지남에 따라 증가하여 표적 단백질의 헬리카제 활성과 상관관계가 있습니다.
MOV10 헬리카제 활성 분석의 경우 원고 지시에 따라 시약을 혼합하고 최종 반응량이 20마이크로리터가 되도록 물을 추가합니다. 섭씨 37도에서 10분, 30분, 60분 동안 반응을 배양한 다음 5X Stop Buffer를 첨가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 20% 천연 폴리아크릴아미드 겔을 준비하고 각 샘플의 20-25마이크로리터를 각 웰에 로드합니다. 브로모페놀 블루 마커가 젤의 하단 4분의 1로 이동할 때까지 얼음 욕조에서 젤을 100볼트로 실행합니다.
아크릴아마이드는 유해하고 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 취급하는 것이 중요합니다.
젤 플레이트를 분해하고 로딩 웰과 사용하지 않는 레인을 제거하여 젤을 트리밍합니다. 겔을 0.5X TBE 완충액에 넣습니다. 여과지와 나일론 멤브레인을 젤 크기로 자르고 종이와 멤브레인을 미리 적시고 전사를 위해 스택을 조립합니다.
20분 동안 90밀리암페어의 반건식 전기영동 장치에서 젤에서 멤브레인으로 샘플을 옮깁니다. 그런 다음 멤브레인을 센티미터당 120밀리줄에서 45-60초 동안 조사하여 샘플을 가교합니다.
화학발광 검출을 위해 멤브레인에 20밀리리터의 차단 완충액을 첨가하고 부드럽게 흔들면서 15-30분 동안 배양하는 것으로 시작합니다. 차단 완충액을 조심스럽게 제거하고 접합체 차단 완충액으로 교체하십시오. 멤브레인을 다시 15분 동안 배양합니다.
세척할 때마다 5분 동안 흔들면서 멤브레인을 4회 세척합니다. 그런 다음 30밀리리터의 기질 평형 완충액을 멤브레인에 첨가하고 20-25RPM에서 흔들면서 5분 동안 배양합니다.
멤브레인의 전체 표면을 기질 작업 용액으로 덮고 5분 동안 배양합니다. 배양 후 화학 발광 이미징 시스템에서 멤브레인을 1-3초 동안 스캔합니다.