DNA 복구 단백질 상호 작용의 면역형광 기반 시각화

방사선 유도 DNA 이중 가닥 절단(DSB)은 손상된 부위에서 DNA 복구 단백질 모집을 시작하여 DNA 복구를 활성화합니다.

간접 면역형광을 사용하여 DSB 부위에서 DNA 복구 단백질 γH2AX 및 53BP1을 검출하려면 상피 세포가 포함된 커버슬립을 채취합니다. 세포의 하위 집합을 조사합니다. 배양하여 대조군 비조사 세포 및 조사 세포가 특정 시간 동안 성장할 수 있도록 합니다.

완충액으로 처리하여 세포핵을 추출합니다. 형태를 보존하기 위해 세포핵을 고정합니다. 비특이적 1차 항체 결합을 최소화하기 위해 차단 용액으로 처리합니다.

두 가지 DNA 복구 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 추가합니다. 항체는 각각의 단백질에 결합합니다.

각각 적색 및 녹색 형광단으로 태그가 지정된 2차 항체와 함께 배양합니다. 각 1차 항체에 특이적인 2차 항체는 표적에 결합합니다. 유리 슬라이드에 DAPI가 포함된 마운팅 매체를 추가합니다. 이미징을 위해 커버슬립을 장착합니다.

DNA 결합 염료인 DAPI는 이중 가닥 DNA의 AT가 풍부한 작은 홈에 결합하여 핵을 대조염색합니다. 형광 현미경을 사용하여 세포 핵을 시각화합니다.

조사되지 않은 세포핵과 비교하여 조사된 핵은 시간이 지남에 따라 감소하는 여러 γH2AX 병소를 나타내며, 이는 장기간 성장한 세포에서 진행적인 DNA 복구를 나타냅니다.

치는 빨간색과 녹색 형광 신호는 노란색으로 나타나며, 이는 조사 후 DSB 부위에서 γH2AX와 53BP1의 공동 국소화를 나타냅니다.

18mm 원형 유리 커버슬립이 있는 12웰 플레이트의 각 웰에서 40,000개의 HeLa 세포를 80% 컨플루시티까지 성장시키는 것으로 시작합니다. 세포를 4 그레이 감마선 조사에 노출시킨 후, PBS 1밀리리터로 2회 세척한다. 그런 다음 PBS를 완전히 제거하고 각 웰에 200마이크로리터의 NEB를 추가합니다. 세포를 실온에서 2분 동안 배양한 다음 NEB를 제거합니다.

배양 시간은 세포주에 따라 다를 수 있지만 일반적으로 2분을 초과해서는 안 됩니다. 1밀리리터의 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 PBS를 완전히 제거하고 세포 고정을 위해 각 웰에 200마이크로리터의 4% PFA를 추가합니다.

세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 배양한 다음 PFA를 제거하고 각 웰에 PBS 1밀리리터를 첨가합니다. PBS를 완전히 제거한 다음 각 웰에 200마이크로리터의 차단 용액을 첨가하고 실온에서 2시간 또는 섭씨 4도에서 16-18시간 동안 세포를 배양합니다.

1차 항체를 희석 완충액에 희석하고 잘 섞일 때까지 소용돌이치게 합니다. 습도 상자에 파라필름 조각을 부착하고 10마이크로리터의 1차 항체를 한 방울에 추가합니다. 웰에서 커버슬립의 한쪽 가장자리를 방울에 맞추고 파라필름 위로 천천히 내려 액체를 퍼뜨립니다. 커버슬립을 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

배양 후, 커버슬립을 PBS에서 세척당 1분 동안 3회 세척합니다. 2차 항체를 희석 완충액에 희석하고 잘 섞일 때까지 소용돌이치게 합니다. 앞서 설명한 대로 각 커버슬립에 10마이크로리터의 2차 항체를 도포하고 빛으로부터 보호된 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

커버슬립을 PBS로 세 번 세척하고 물로 한 번 세척할 때마다 1분 동안 세척합니다. 그런 다음 DAPI가 포함된 글리세롤 기반 마운팅 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착합니다. 투명한 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하고 20분 동안 건조시킵니다. 60X 대물 렌즈에 침지 오일 한 방울을 놓고 DAPI를 사용하여 접안렌즈를 통해 핵을 찾습니다.

XYZ 이미지 획득의 경우 획득 소프트웨어를 열고 "스캐너 유형"을 "Galvano"로, "스캐너 모드"를 "왕복"으로, "512 x 512" 이미지 크기를 설정합니다. [PMT] 패널에서 [모드]를 [VBM]으로, [평균]을 [프레임]으로, [순차 스캔]을 [선]으로 설정합니다. 다음으로 염료 및 열 감지기를 설정합니다. 채널 1을 DAPI 및 SD1로, 채널 2를 Alexa Fluor 488 및 HSD3으로, 채널 3을 Alexa Fluor 647 및 HSD4로 설정합니다. "Z"에서 "ON"을 선택합니다.

라이브 이미지를 조정하려면 라이브 창의 라이브 버튼을 누르고 초점을 조정합니다. 그런 다음 "PMT 도구" 창을 사용하여 레이저 강도, 감도, 게인 및 오프셋을 설정합니다. Z 스택의 경우 시작에서 끝까지 및 15개의 슬라이스를 선택합니다. 이미지를 저장할 폴더를 선택하고 LSM 시작 버튼을 눌러 획득을 시작합니다. 완료되면 시리즈 완료 버튼을 눌러 이미지 획득을 완료합니다.