친화성 추출을 통해 RNA 결합 단백질을 분리하기 위한 RNA-단백질 풀다운 분석

RNA 결합 단백질 또는 RBP(전사 후 조절인자)를 분리하려면 표적 RBP에 의해 인식되는 서열인 아데닐레이트-우리딜레이트 풍부 요소(ARE)를 포함하는 작은 RNA 프로브의 현탁액을 사용합니다. RNA 프로브는 비오틴 유도체인 데스티오비오틴으로 표지되어 있습니다.

비오틴에 친화력이 있는 단백질인 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 비드를 추가합니다. 구슬이 가라앉지 않도록 교반하면서 배양합니다. 데스티오비오틴 표지 RNA는 스트렙타비딘에 결합하여 비드에 RNA를 고정시킵니다.

자기장 아래에서 구슬은 튜브 측면에 모입니다. 상청액을 제거합니다. RBP-RNA 결합을 위한 최적의 pH를 제공하는 완충액에 비드를 재현

자석에 노출되면 구슬이 튜브 측면에 모입니다. 상청액을 버리십시오. 표적 RBP를 포함하는 용액에 비드를 재현탁하고 교반하면서 배양합니다.

표적 RBP는 ARE 서열을 인식하고 RNA에 결합하는 RNA 인식 모티프를 가지고 있어 비드에 고정된 RNA-단백질 복합체를 형성합니다.

자기장 아래에서 비드는 단백질-RNA 상호 작용을 방해하지 않고 자석을 향해 이동합니다. 상청액을 버리십시오. 비오틴이 함유된 용출 완충액에 비드를 재현탁합니다.

비오틴은 스트렙타비딘에 경쟁적으로 결합하여 비드에서 데스티오비오틴을 대체하여 단백질-RNA 복합체를 용출합니다.

단백질-RNA 상호작용을 확인하기 위해 용출액에서 표적 RBP의 존재를 평가합니다.

RNA 50피코몰당 50마이크로리터의 스트렙타비딘-자성 비드를 미리 세척합니다. 스트렙타비딘-자성 비드로 튜브를 15초 동안 소용돌이치게 합니다. 빠르게 소용돌이치면 절단된 피펫 팁을 사용하여 깨끗한 1.5밀리리터 안전 잠금 튜브에 200마이크로리터를 제거합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 올려 비드가 튜브 측면에 모이도록 하고 1분 정도 기다립니다. 재현탁액을 제거합니다.

비드를 세척하려면 400몰 수산화나트륨, 0.1몰 염화나트륨 용액 0.05마이크로리터의 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 부드럽게 위아래로 여러 번 피펫팅합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 1분 정도 기다린 다음 상청액을 수집합니다.

200마이크로리터의 100밀리몰 염화나트륨으로 비드를 세척하고 상청액을 제거합니다. 200밀리몰 트리스 200마이크로리터를 추가합니다. 피펫팅으로 비드를 재현탁하고 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 1분 후 상청액을 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 1x RNA 캡처 완충액에서 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 스트렙타비딘-마그네틱 비드를 잠시 소용돌이치면서 재현탁합니다.

50마이크로리터의 스트렙타비딘-마그네틱 비드를 제거하고 절단된 피펫 팁을 사용하여 각 표지된 RNA 튜브에 추가합니다. 롤러에서 실온에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 놓은 후 상청액을 제거합니다. 20밀리몰 트리스 50마이크로리터를 구슬에 넣고 재현탁합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 1분 후 상청액을 제거합니다.

100마이크로리터의 1x 단백질-RNA 결합 완충액을 비드에 첨가하고 재현탁합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓습니다. 튜브가 1분 동안 스탠드에 있으면 상청액을 수집합니다. 100마이크로리터의 마스터 믹스 B를 추가합니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 재현탁하고 기포가 생기지 않도록 합니다. 반응 튜브를 롤러에서 섭씨 4도에서 60분 동안 배양합니다.

세척 및 용출 단계로 넘어갑니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 흐름을 수집하여 새 튜브로 옮깁니다. 100마이크로리터의 1X 세척 완충액을 비드에 피펫팅합니다. 부드럽게 재현탁하십시오. 스탠드에 다시 놓습니다. 1분 정도 기다렸다가 상청액을 버립니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.

마그네틱 비드에 40마이크로리터의 용출 완충액을 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 튜브 셰이커에서 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 1분 정도 기다린 다음 용출액을 수집합니다. 얼음 위에 놓고 다운스트림 분석에 사용합니다.