단백질-리간드 상호 작용을 모니터링하기 위한 정량적 세포 내 수소 NMR 분광법

천연 세포 환경에서 표적 단백질과 소분자 테스트 리간드의 상호 작용을 모니터링하려면 베이스에 겔 플러그가 포함된 완충액으로 채워진 NMR 튜브로 시작합니다. 아가로스에 포매된 표적 단백질 발현 세포를 NMR 튜브에 주입하여 실과 같은 구조를 형성합니다.

튜브를 바이오리액터의 유량 장치에 로드하여 세포 생존력을 유지하기 위해 성장 배지를 공급합니다. 핵 자기 공명 또는 NMR 기기 내부에 유량 장치를 삽입합니다.

강한 자기장 하에서 단백질의 수소 원자 원자는 자화되어 자기장과 평행하게 정렬되어 저에너지 상태에 적응합니다.

고주파 펄스를 적용하여 핵이 자기장에 반대 평행하게 정렬되도록 하여 더 높은 에너지 상태로 전환할 수 있도록 합니다.

짧은 펄스 후 핵은 원래 위치로 돌아가 흡수된 에너지를 방출합니다. 검출기는 이 에너지를 포착하여 수소 원자의 공명 주파수를 나타내는 NMR 스펙트럼을 생성합니다. 각 스펙트럼 피크는 특정 전자 환경에서 서로 다른 수소 원자에 해당합니다.

유량 단위에 리간드 분자를 추가합니다. 이들은 세포 내부에 침투하여 표적 단백질과 상호 작용하며 수소 원자 주변의 전자 환경을 변경하여 공명 주파수 변화를 일으킵니다.

NMR 스펙트럼을 비교하십시오. 리간드 결합 후 스펙트럼 차이는 성공적인 단백질-리간드 상호작용을 나타냅니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 유량 단위 NMR 튜브의 바닥에 60-70마이크로리터의 1.5% 아가로스 겔을 채우고 얼음 위에 올려 5mm 높이의 바닥 플러그를 만듭니다. 블록 히터에서 세포 펠릿을 15-20초 동안 가열하고 기포 형성을 피하면서 세포를 450마이크로리터의 아가로스 용액에 조심스럽게 재현탁합니다.

세포-아가로스 현탁액을 1밀리리터 주사기에 연결된 내경 0.75mm의 30cm 길이의 크로마토그래피 PEEK 튜브로 흡인합니다. 튜브를 실온에서 2분 동안 식히십시오. 실온에서 100마이크로리터의 PBS로 유량 단위 NMR 튜브를 미리 채웁니다. 주사기를 부드럽게 밀어 아가로스에 포매된 세포 실을 유동 장치 NMR 튜브에 주조합니다.

유량 장치에서 빈 NMR 튜브를 제거하고 몇 분 동안 유속을 분당 2밀리리터로 높여 입구 튜브에 남아 있는 기포를 제거합니다. 유속을 분당 0.2밀리리터로 설정하고 세포가 들어 있는 NMR 튜브를 천천히 그러나 꾸준히 위쪽으로 밀어 삽입합니다. 분당 0.1밀리리터의 유속으로 바이오리액터 배지를 공급합니다.

NMR 분광계의 온도를 310켈