단백질 올리고머를 위한 Multi-Angle Light Scattering을 사용한 크기 배제 크로마토그래피

단백질 올리고머는 더 큰 기능 단위를 형성하기 위해 함께 결합된 여러 단백질 서브유닛의 복합체입니다.

크기 배제 크로마토그래피와 다각도 광산란의 조합인 SEC-MALS를 통해 용액 내 단백질 단량체 및 올리고머의 분자량을 측정하려면 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼으로 시작합니다.

컬럼에는 더 작은 크기의 분자를 가두는 다공성 체 모양의 구형 젤 비드가 포함되어 있습니다. 단백질의 천연 상태와 호환되는 완충액으로 컬럼의 평형을 유지합니다.

단백질 단량체와 올리고머가 포함된 샘플을 컬럼 상단에 로드합니다.

흐름 중에 올리고머는 컬럼의 입자간 공간을 통과하는 반면 단량체는 비드의 기공 내에 갇히게 됩니다. 이로 인해 더 큰 크기의 단백질 올리고머가 더 작은 크기의 단량체보다 더 빠르게 이동합니다.

빠르게 용출되는 올리고머와 느리게 용출되는 단량체를 MALS 검출기로 향하게 합니다.

검출기를 통과할 때 레이저 광이 그들을 비추고 다양한 각도로 산란됩니다. 다중 서브유닛 올리고머는 단량체보다 더 많은 빛을 산란시킵니다.

여러 각도에서 산란된 빛의 강도는 단백질 올리고머와 단량체의 분자량에 정비례합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SEC-MALS 시스템을 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. HPLC 등급 시약을 사용하여 50-100밀리리터의 염화나트륨과 함께 1리터의 인산염 완충 식염수를 준비합니다. 병탑 폴리에테르 설폰 필터 또는 이와 유사한 것을 사용하여 완충액을 0.1미크론으로 여과합니다.

건식 필터에서 미립자를 제거하기 위해 처음 50-100밀리리터의 완충액을 폐기물 병에 걸러냅니다. 그런 다음 나머지는 이전에 여과된 탈이온수로 세척하고 먼지가 들어가지 않도록 보관한 깨끗하고 멸균된 병으로 여과합니다.

분당 0.5밀리리터의 유속으로 컬럼을 밤새 세척하여 버퍼에서 컬럼을 평형을 유지하고 미립자를 제거합니다. FPLC의 "연속 흐름" 모드를 사용하고 모든 SEC-MALS 실행이 완료될 때까지 흐름이 중지되지 않도록 합니다. 하룻밤 세척하는 동안 dRI 플로우 셀을 퍼지 모드로 전환합니다.

플러시를 시작할 때 컬럼의 급격한 압력 변화로 인한 "컬럼 흘리기" 효과를 방지하기 위해 유속을 점차적으로 증가시키십시오. 샘플 실행을 시작하기 전에 퍼지를 끕니다.

컬럼의 하류에 있는 튜브를 가볍게 두드려 축적된 입자를 방출하여 시스템 청결도를 확인합니다. MALS 기기의 전면 패널 디스플레이에 있는 90도 감지기의 신호를 관찰합니다. 피크 간 노이즈가 50-100마이크로볼트를 넘지 않는지 확인합니다. 또한 굴절률 또는 RI 신호가 1 x ^10-7 굴절률 단위 미만으로 안정적인지 확인합니다.

'블랭크' 주입을 수행하여 인젝터에 입자가 없는지 확인합니다. '블랭크'는 단순히 신선한 멸균 바이알에서 준비된 실행 완충액입니다. 입자 피크의 부피가 1밀리리터 이하이고 기준선보다 5밀리볼트 이하인 경우 시스템은 샘플을 사용할 준비가 된 것입니다. 그렇지 않으면 깨끗해질 때까지 추가 블랭크 주입을 수행하거나 유지 보수를 수행하여 인젝터를 청소하십시오.

이제 SEC 완충액에서 밀리리터당 1-2밀리그램으로 최소 200마이크로리터의 BSA를 준비합니다. 주사기 팁 필터를 사용하여 단백질을 0.025미크론까지 여과합니다. 건조 필터에서 입자를 제거하기 위해 여과액의 처음 몇 방울을 버리십시오. 또는 샘플을 10,000배 g에서 15분 동안 원심분리하여 불용성 응집체 및 기타 큰 입자를 침전시킬 수 있습니다. 그런 다음 100마이크로리터의 BSA 용액을 루프에 주입합니다.