수용체-리간드 상호작용을 방해하는 화합물을 식별하기 위한 경쟁력 있는 결합 분석

경쟁적 결합 분석은 표적 수용체에 경쟁적으로 결합하여 자연 리간드 결합을 억제함으로써 수용체-리간드 상호작용을 방해하는 소분자를 식별합니다.

수용체 특이적 소분자 길항제의 존재 하에서 수용체와 천연 리간드의 상호작용을 확인하려면 표적 수용체를 발현하는 인간 T-림프구 세포의 현탁액으로 시작합니다.

증가하는 길항제 농도를 포함하는 다중 웰 플레이트의 웰에 세포 현탁액을 추가합니다. 인큐베이트. 길항제는 수용체의 자연적인 리간드 결합 부위인 오르스테릭 결합 부위에 결합합니다.

고정 농도의 형광 표지 천연 리간드를 웰에 추가합니다. 인큐베이트.

낮은 농도에서 길항제는 거의 오르트스테릭 결합 부위를 차지하지 않아 수용체에 대한 자연적인 리간드 결합을 허용합니다. 그러나 더 높은 농도에서는 길항제가 대부분의 오르스테릭 결합 부위를 차지하여 최소한의 천연 리간드-수용체 결합을 허용합니다.

원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 버리십시오. 세포를 파라포름알데히드에 재현탁시켜 고정하고 세포 형태를 보존합니다.

유세포 분석기를 사용하여 길항제 및 형광 리간드 결합 수용체를 발현하는 개별 T-림프구의 형광 신호를 분석합니다.

수용체 특이적 길항제 농도가 증가함에 따라 평균 형광 강도의 용량 의존적 감소는 길항제가 오르스테릭 수용체 결합 부위에 경쟁적으로 결합하여 자연적인 리간드-수용체 상호작용을 억제함을 나타냅니다.

시작하려면 사전 정의된 실험 레이아웃에 따라 100마이크로리터의 화합물 용액을 투명한 96웰 둥근 바닥 플레이트에 분배합니다.

다중 채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 50마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.

배양 후, 유사한 시약 저장소에서 50마이크로리터의 형광 표지된 100나노그램/밀리리터 CXCL12를 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 96웰 플레이트를 400배 중력으로 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 펠릿 세포에서 상청액을 제거합니다. 티슈에 접시를 말리십시오. 다중 채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 200마이크로리터의 신선한 분석 완충액을 웰에 추가합니다.

즉시 실온에서 400배 중력으로 5분 동안 플레이트를 다시 원심분리합니다. 다시 접시를 뒤집어 상청액을 제거한 다음 티슈 위에서 건조시킵니다. 마지막으로, PBS에 용해된 200마이크