수용체-리간드 상호작용을 방해하는 화합물을 식별하기 위한 경쟁력 있는 결합 분석

경쟁적 결합 분석은 표적 수용체에 경쟁적으로 결합하여 자연 리간드 결합을 억제함으로써 수용체-리간드 상호작용을 방해하는 소분자를 식별합니다.

수용체 특이적 소분자 길항제의 존재 하에서 수용체와 천연 리간드의 상호작용을 확인하려면 표적 수용체를 발현하는 인간 T-림프구 세포의 현탁액으로 시작합니다.

증가하는 길항제 농도를 포함하는 다중 웰 플레이트의 웰에 세포 현탁액을 추가합니다. 인큐베이트. 길항제는 수용체의 자연적인 리간드 결합 부위인 오르스테릭 결합 부위에 결합합니다.

고정 농도의 형광 표지 천연 리간드를 웰에 추가합니다. 인큐베이트.

낮은 농도에서 길항제는 거의 오르트스테릭 결합 부위를 차지하지 않아 수용체에 대한 자연적인 리간드 결합을 허용합니다. 그러나 더 높은 농도에서는 길항제가 대부분의 오르스테릭 결합 부위를 차지하여 최소한의 천연 리간드-수용체 결합을 허용합니다.

원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 버리십시오. 세포를 파라포름알데히드에 재현탁시켜 고정하고 세포 형태를 보존합니다.

유세포 분석기를 사용하여 길항제 및 형광 리간드 결합 수용체를 발현하는 개별 T-림프구의 형광 신호를 분석합니다.

수용체 특이적 길항제 농도가 증가함에 따라 평균 형광 강도의 용량 의존적 감소는 길항제가 오르스테릭 수용체 결합 부위에 경쟁적으로 결합하여 자연적인 리간드-수용체 상호작용을 억제함을 나타냅니다.

시작하려면 사전 정의된 실험 레이아웃에 따라 100마이크로리터의 화합물 용액을 투명한 96웰 둥근 바닥 플레이트에 분배합니다.

다중 채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 50마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.

배양 후, 유사한 시약 저장소에서 50마이크로리터의 형광 표지된 100나노그램/밀리리터 CXCL12를 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 96웰 플레이트를 400배 중력으로 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 펠릿 세포에서 상청액을 제거합니다. 티슈에 접시를 말리십시오. 다중 채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 200마이크로리터의 신선한 분석 완충액을 웰에 추가합니다.

즉시 실온에서 400배 중력으로 5분 동안 플레이트를 다시 원심분리합니다. 다시 접시를 뒤집어 상청액을 제거한 다음 티슈 위에서 건조시킵니다. 마지막으로, PBS에 용해된 200마이크로리터의 1% 파라포름알데히드에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 이 단계에서는 셀을 수정합니다.

유세포 분석으로 샘플을 분석하려면 장치를 시작하고 해당 소프트웨어를 엽니다. 도트 블롯 형식으로 시각화할 세포 매개변수를 전방 산란 영역, 측면 산란 영역 및 히스토그램 보기에서 형광단 검출 채널로 선택합니다.

예를 들어 음성 대조군 샘플과 같은 하나의 샘플을 선택하여 전방 산란 및 측면 산란 매개변수를 기반으로 정의된 균질 세포 집단의 게이팅을 수행합니다. 세포를 유세포 분석 장치에 로드하기 위한 설정을 조정합니다.

주입하기 전에 세 가지 혼합물을 선택하십시오. 100마이크로리터의 고정 세포의 자동 주입을 선택하고 초당 1.5마이크로리터의 샘플 유량을 사용합니다. "데이터 수집"을 선택하여 샘플을 실행합니다. 이 샘플에 대한 전방 산란 및 측면 산란 매개변수와 형광단 검출이 이제 화면에 나타납니다.

이제 소프트웨어의 게이팅 도구를 선택합니다. 전방 산란 및 측면 산란 도트 블롯 플롯 시각화를 기반으로 게이팅을 통해 균질하고 생존 가능한 세포 집단을 미리 정의합니다. 샘플당 20,000개의 "이벤트"를 분석하려면 선택합니다.

즉, 각 샘플에 대해 미리 정의된 게이트 내에 속하는 20,000개의 세포가 결국 분석됩니다. 데이터 수집은 이 이벤트 수에 도달할 때까지 계속됩니다.

분석할 웰을 먼저 선택하여 실행을 시작합니다. 그런 다음 "Run Wells"를 선택합니다.

유세포 분석 장치는 이제 사전 정의된 게이트 내에 있는 20,000개 세포의 평균 형광 신호에 해당하는 각 샘플의 평균 형광 강도를 기록하여 이러한 샘플을 하나씩 분석합니다.

마지막으로 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다.