0 조회수 • 3:35 분 • July 8th, 2025
수용체-리간드 상호작용을 연구하려면 표면에 테스트 리간드를 발현하는 표적 세포가 있는 배지가 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.
조작된 마우스 BW 세포(막 결합 키메라 수용체를 발현하는 새로운 B 세포 집단)를 추가합니다. 키메라 수용체는 B 세포 수용체의 막관통 및 세포내 신호 전달 도메인에 융합된 특정 수용체의 세포외 도메인을 포함합니다.
표적 세포의 리간드는 BW 세포의 키메라 수용체의 세포외 도메인과 상호 작용하여 BW 세포에서 세포내 신호 전달 도메인 활성화를 유발합니다. 이것은 다운스트림 신호 전달과 사이토카인(BW 세포 외부에서 방출되어 배지에 나타나는 분비 리포터 분자)의 생성을 촉발합니다.
플레이트를 원심분리합니다. 사이토카인 함유 상청액을 항사이토카인 항체로 미리 코팅된 ELISA 플레이트로 옮깁니다. 사이토카인은 항체의 Fab 영역과 상호 작용하여 플레이트 표면에 고정됩니다.
비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 차단 용액으로 플레이트를 처리합니다. 사전 결합된 사이토카인과 상호 작용하여 면역 복합체를 형성하는 비오티닐화된 항사이토카인 항체를 추가합니다.
효소 결합 스트렙타비딘 용액으로 플레이트를 오버레이합니다. 스트렙타비딘은 면역 복합체의 비오틴과 결합합니다.
플레이트를 기판으로 처리하십시오. 효소-기질 상호 작용은 유색 제품을 생성하여 용액에 동일한 색상을 부여합니다. 유색 용액은 리포터 분자의 존재를 확인하여 성공적인 수용체-리간드 상호작용을 나타냅니다.
50,000개의 형질감염된 BW 세포를 원하는 표적과 함께 96웰 플레이트의 단일 웰에 사용합니다. 플레이트를 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음 접시를 섭씨 -20도에서 얼립니다.
ELISA 플레이트를 항-마우스 IL-2 항체로 코팅합니다. 각 웰에 50마이크로리터의 PBS 부피에 0.05% 마이크로그램의 항마우스-IL-2를 넣습니다. 코팅된 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
섭씨 37도에서 짧은 배양 기간을 사용하여 이전에 표적과 함께 배양된 냉동 BW 세포를 해동합니다. 그런 다음 플레이트를 원심분리하고 각 웰에서 100마이크로리터의 상청액을 사전 코팅된 ELISA 플레이트로 옮기고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.
그런 다음 비오틴 항-마우스-IL-2를 ELISA 플레이트에 첨가합니다. 그런 다음 배양 및 세척 후 HRP 결합 스트렙타비딘을 플레이트에 첨가합니다. 배양 및 세척 후, ELISA 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 TMB 기질 용액을 첨가합니다. 마지막으로 650나노미터에서 ELISA 플레이트를 읽습니다.