수용체-리간드 상호작용을 정량화하기 위한 Biomembrane Force 프로브

T 세포 수용체인 TCR과 항원 제시 세포인 APC에서 MHC 또는 주요 조직적합성 복합체에 의해 제시되는 항원 펩타이드 사이의 상호 작용은 T 세포가 APC에 기계적 힘을 가하도록 합니다. 이 현상은 T 세포 활성화에 필요합니다.

생체막 힘 프로브인 BFP를 사용하여 수용체-리간드 상호작용을 정량화하려면 슬라이드 기반 맞춤형 세포 챔버로 시작합니다. 세포 챔버를 현미경 아래에 놓습니다.

비오티닐화된 부풀어 오른 적혈구의 현탁액, 펩타이드 결합 MHC-스트렙타비딘-비오틴 복합체로 코팅된 프로브 유리 비드 및 T 세포를 챔버에 주입합니다. 프로브, 타겟 및 헬퍼 완충액으로 채워진 마이크로피펫을 챔버 주위에 배치합니다.

프로브 피펫으로 비오티닐화된 적혈구를 흡인하여 빈 영역에 배치합니다. 표적 마이크로피펫으로 T 세포를 흡인하여 적혈구의 오른쪽에 배치합니다. 도우미 마이크로피펫으로 프로브 비드를 흡인하고 RBC의 정점에 부착합니다. 비드의 스트렙타비딘은 적혈구의 비오틴에 결합하여 힘 프로브를 형성합니다.

T 세포를 힘 프로브에 정렬하여 TCR이 리간드(MHC 결합 펩타이드)와 상호 작용하고 T 세포가 RBC에 힘을 가할 수 있도록 합니다. T 세포를 후퇴시켜 TCR-펩티드 결합을 끊어 적혈구를 변형시키고 비드를 변위시킵니다.

결합을 끊는 데 필요한 힘을 측정하십시오 — 결합이 강할수록 더 높은 힘과 끊는 데 더 많은 시간이 필요하므로 수명이 더 길다는 것을 나타냅니다.

BFP 실험을 시작하려면 현미경과 광원을 켜십시오. 챔버를 메인 현미경 스테이지에 놓습니다. 다음 단계는 BFP의 세 가지 마이크로피펫을 모두 설치하는 것입니다. 왼쪽의 프로브는 적혈구를 잡는 것입니다. 오른쪽의 목표는 세포를 잡는 것이고, 오른쪽 하단의 도우미는 구슬을 잡는 역할을 합니다.

설치하려면 마이크로 인젝터를 사용하여 마이크로피펫을 실험용 완충액으로 다시 채우십시오. 피펫 홀더에서 마이크로피펫을 꺼내 팁에서 액체가 떨어지도록 낮은 곳에 잡습니다. 마이크로피펫을 홀더 팁에 빠르게 삽입하고 삽입하는 동안 마이크로피펫에 공기 미세 기포가 들어가지 않도록 합니다.

홀더 나사를 조인 다음 각 피펫 홀더를 해당 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. 마이크로피펫을 챔버 쪽으로 밀어 팁이 챔버 완충 영역에 들어가도록 합니다. 마이크로피펫의 위치를 조정하고 현미경 시야 아래에서 찾으십시오.

챔버 홀더의 스테이지 주위를 이동하여 세 원소의 식민지를 하나씩 찾으세요. 마이크로피펫의 끝이 하나의 셀 또는 비드에 접근하도록 매니퓰레이터의 손잡이를 돌려 해당 마이크로피펫의 위치를 조정합니다. 해당 마이크로피펫 내부의 압력을 조정하여 세포 또는 비드를 흡인합니다. 세 개의 마이크로피펫 모두 해당 요소를 포착합니다.

챔버 홀더 스테이지 주위를 이동하여 실험이 수행될 주입된 요소의 콜로니에서 멀리 떨어진 열린 공간을 찾습니다.

현미경 시각 모드를 전환하여 컴퓨터 프로그램에서 이미지를 시각화합니다. 피펫 팁의 세 가지 요소를 모두 프로그램의 시야로 이동합니다. 그런 다음 프로브 비드와 적혈구를 정렬하고 프로브 비드를 적혈구의 정점에 조심스럽게 움직입니다. 이제 비드를 적혈구에 잠시 부딪히고 부드럽게 집어넣습니다.

도우미 마이크로피펫의 압력을 조정하여 비드가 RBC 정점에 접착되도록 부드럽게 불어냅니다. 도우미 마이크로피펫을 멀리 옮기고 타겟과 프로브 비드를 정렬합니다.

프로그램의 비전 필드 창에서 프로그램 도구를 사용하여 프로브 마이크로피펫, 적혈구 및 적혈구와 프로브 비드 사이의 원형 접촉 면적의 각 반경을 측정합니다. 이 값을 사용하면 텍스트 프로토콜에 나열된 방정식에 의해 RBC의 스프링 상수를 추정

원하는 RBC 스프링 상수를 프로그램에 입력한 후 RBC 정점을 가로질러 수평선을 그리면 이 선을 따라 각 픽셀의 밝기를 나타내는 인접한 창에 곡선이 생성됩니다. 임계값 선을 드래그하여 곡선 깊이의 절반 정도가 되도록 합니다.

그런 다음 원하는 실험 모드를 선택합니다. 원하는 대로 매개변수를 설정합니다. 시작을 클릭하면 프로그램이 대상 피펫을 이동하고 대상을 프로브와 접촉 안팎으로 몰아넣을 수 있습니다.

데이터 수집은 프로브 비드의 위치를 실시간으로 기록하는 병렬로 수행됩니다. 버튼을 클릭하여 프로그램을 중지합니다 실험 중지 이때 획득한 데이터를 저장할 수 있는 창이 나타납니다.