0 조회수 • 4:05 분 • July 8th, 2025
GTPase의 범주인 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질은 GTP 결합 활성 형태와 GDP 결합 비활성 형태 사이를 순환하는 분자 스위치 역할을 합니다.
활성 GTPase는 특정 단백질 파트너에 결합합니다. 이러한 파트너는 GTPase에서 동일한 결합 부위를 놓고 경쟁합니다.
경쟁적 결합을 연구하려면 마그네틱 비드에 고정된 GTP 결합 GTPase의 현탁액을 복용하는 것부터 시작합니다. 첫 번째 상호 작용 파트너인 형광 태그 단백질 A를 추가합니다. 교반하면서 배양하여 비드를 현탁액 상태로 유지합니다. 단백질 A는 모든 GTPase 분자의 결합 부위에 결합하고 포화시킵니다.
이 용액을 여러 튜브로 균등하게 나눕니다. 두 번째 상호 작용 파트너인 형광 태그 단백질 B를 튜브에 점점 더 많은 양으로 추가합니다. 교반하면서 배양합니다.
단백질 B는 GTPase의 동일한 결합 부위에 결합하여 단백질 A를 경쟁적으로 대체합니다.
튜브를 자기장에 노출시켜 한쪽에 비드를 모으십시오. 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 상청액을 버립니다. 단백질 복합체 비드를 적절한 완충액에 재현탁하고 결합된 단백질을 정량화합니다.
단백질 B의 각 농도에서 GTPase에 결합된 단백질 A와 B의 상대적 강도를 플로팅합니다.
단백질 B는 단백질 A보다 상대적으로 낮은 농도로 GTPase 분자의 절반 결합 부위를 차지하는 평형에 도달하며, 이는 GTPase에 대한 단백질 B의 친화력이 더 높다는 것을 나타냅니다.
경쟁 결합을 수행하려면 각각 200마이크로리터의 경쟁 결합 완충액을 포함하는 6개의 미세분리기 튜브를 설정합니다. 각 튜브에는 10마이크로리터의 뉴클레오티드 로딩 Rac1 비드와 5마이크로리터의 Rac1 결합 단백질 A가 일정한 결합 단백질로 포함되어야 합니다.
각 튜브에 0, 1, 2.5, 5, 10 또는 20마이크로리터의 Rac1 결합 단백질 B를 가변 결합 단백질로 첨가합니다. 이러한 부피는 일정하고 가변적인 결합 단백질의 스톡 농도가 거의 동일하다고 가정하며 조정이 필요할 수 있습니다.
경쟁 결합 완충액을 첨가하여 결합 혼합물의 총 부피를 235마이크로리터로 구성합니다. 다음으로, 200마이크로리터의 경쟁 완충액, 10마이크로리터의 실험용 뉴클레오티드 로드 Rac1 비드 및 10마이크로리터의 Rac1 결합 단백질 A가 들어 있는 미세분리기 튜브를 설정합니다.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 GDP, GTPγS 및 뉴클레오티드 컨트롤 튜브를 설정합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 반전시켜 혼합하여 2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 경쟁 결합 완충액으로 비드를 세 번 세척합니다.
마지막으로, 결합된 단백질을 20마이크로리터의 환원 샘플 완충액으로 용리합니다.