바이러스 항원에 대한 혈청 내 항체 동형을 검출하기 위한 바이러스 항원 마이크로어레이 분석

준비된 바이러스 항원 마이크로어레이 슬라이드로 바이러스 항원 마이크로어레이 분석을 시작합니다.

슬라이드에는 여러 개의 패드가 포함되어 있으며, 각 패드에는 여러 바이러스 균주의 수백 개의 정제된 항원이 그리드로 배열된 지점에 인쇄된 단일 어레이가 있습니다. 각 스폿에는 3차원 미세 다공성 니트로셀룰로오스 표면에 흡착된 단일 항원 유형이 포함되어 있습니다.

후속 단계에서 쉽게 다룰 수 있도록 슬라이드를 챔버에 고정합니다. 슬라이드의 나머지 표면에 결합하는 단백질을 포함하는 차단 완충액을 추가하여 표면에 대한 항체의 비특이적 결합을 방지합니다.

마이크로어레이 슬라이드를 희석된 인간 혈청과 함께 배양합니다. 슬라이드의 항원에 특이적인 혈청 내 항체 이소형은 항원의 에피토프를 인식하고 결합합니다.

세럼을 제거합니다. 완충액으로 세척하여 슬라이드에서 결합되지 않은 항체와 단백질을 제거합니다.

각각 다른 양자점을 가진 양자점 접합 2차 항체 혼합물을 추가합니다. 이소형 특이적 2차 항체는 슬라이드의 항원에 결합된 각각의 혈청 항체 이소형에 특이적으로 결합합니다.

마이크로어레이 이미저를 사용하여 마이크로어레이 슬라이드 내의 항원에 대한 항체 결합을 정량화합니다.

적절한 파장에서 여기되면 2차 항체에 결합된 양자점은 바닥 상태로 돌아가 광검출기에 의해 감지되는 특정 형광 신호를 방출합니다.

스폿 형광 강도는 개별 항원에 결합된 혈청 내의 혈청 항체 이소형을 정량화합니다.

원하는 프로토콜로 인쇄 소프트웨어를 프로그래밍한 후 인쇄 실행을 시작합니다. 완료되면 프로브되지 않은 마이크로어레이 슬라이드를 실온의 데시케이터 캐비닛의 차광 상자에 넣습니다.

마이크로어레이에서 항체에 대한 혈청을 조사하려면 클립을 사용하여 마이크로어레이 슬라이드 패드 면을 위로 향하게 하여 프로빙 챔버에 부착하고 챔버를 프레임에 배치합니다.

슬라이드는 쉽게 파손되므로 조립할 때 주의하고, 수분 보충 후 누출이 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 슬라이드를 분해했다가 다시 조립하여 누출을 수정하십시오.

웰당 100마이크로리터의 여과된 차단 완충액으로 슬라이드를 재수화하고 샘플당 100마이크로리터의 차단 완충액으로 혈청을 1:100 비율로 희석합니다. 그런 다음 재수화된 마이크로어레이 슬라이드와 희석된 혈청을 실온에서 30분 동안 오비탈 셰이커에서 분당 100-250회 회전 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 2차 수집 플라스크가 있는 진공 라인에 연결된 피펫 팁을 사용하여 패드를 건드리지 않고 각 챔버의 모서리에서 차단 완충액을 조심스럽게 흡인하고 패드가 건조되지 않도록 희석된 혈청을 즉시 패드에 추가합니다. 그런 다음 습도를 유지하기 위해 밀봉된 축축한 종이 타월이 들어 있는 트레이에 뚜껑을 놓고 흔들리는 셰이커에서 밤새 프레임을 섭씨 4도에서 배양합니다.

양자 점 접합 2차 항체 라벨링의 경우, 방금 시연한 대로 혈청을 조심스럽게 흡인하고 궤도 셰이커에서 각각 5분 동안 웰당 100마이크로리터의 신선한 T-TBS 완충액으로 슬라이드를 세 번 세척하여 헹굽니다. 그런 다음 슬라이드를 양자-점-접합 2차 항체의 혼합물과 함께 배양한 다음 방금 시연한 것과 동일한 기술을 사용하여 프로토콜에 설명된 대로 3회 세척합니다.

마지막 세척 후 챔버에서 슬라이드를 조심스럽게 제거하고 여과된 이중 증류수로 슬라이드를 부드럽게 헹구고 각 슬라이드를 50밀리리터 튜브에 넣습니다. 그런 다음 원심분리로 슬라이드를 건조시킵니다.

마이크로어레이 슬라이드의 이미지를 획득하려면 먼저 휴대용 이미저를 켜고 이미징할 슬라이드를 앞면이 아래로 향하게 하여 이미징 챔버의 슬라이드 홀더에 조심스럽게 놓습니다. 이미징 소프트웨어를 열고 "Configure Imager" 탭에서 적절한 슬라이드 구성을 선택합니다.

"Image Control" 탭에서 적절한 형광 채널을 선택하고 세라의 반응성에 따라 노출 및 획득 시간을 조정합니다. 그런 다음 '캡처'를 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. 획득이 끝나면 기준 마커 방향의 그리드를 사용하여 어레이 스팟을 감지합니다.