살아있는 세포에서 수용체-리간드 상호작용을 시각화하기 위한 Lattice Light Sheet 현미경 검사

격자 광시트 현미경(LLSM)을 사용하면 높은 시공간 해상도로 살아있는 세포에서 세포-표면 수용체-리간드 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

적색 형광을 방출하는 형질도입된 리간드 발현 세포가 포함된 커버슬립을 가져 가십시오. 커버슬립 셀을 위로 향하게 하여 기름칠한 샘플 홀더에 부착합니다. 현미경 스테이지의 피에조에 홀더를 고정하여 이미징 중에 정확한 샘플 위치 지정 및 스캐닝을 허용합니다. 단일 리간드 발현 세포에 초점을 맞추도록 소프트웨어 설정을 조정합니다.

수용체 발현 세포 현탁액을 커버슬립에 피펫팅합니다. 수용체는 녹색 형광단 표지 항체로 태그가 지정됩니다. 상호 작용하는 세포 쌍을 이미지화합니다.

현미경의 여기 레이저는 원통형 렌즈를 통과하여 라이트 시트를 만드는 원형, 선형 편광 레이저 빔을 방출합니다. 라이트 시트는 과도한 회절을 제거하고 초박형 격자 패턴으로 변환하는 변조기에 투사됩니다.

격자 광 시트는 상호 작용하는 셀 쌍의 초박형 부분을 비추고 상호 작용하는 셀에서 방출되는 형광은 입사 빔에 수직으로 포착됩니다. 여러 Z-평면에서 상호 작용하는 셀 쌍을 이미지화하고 고속 카메라로 각 초점면에서 2차원 이미지를 캡처합니다.

적절한 소프트웨어를 사용하여 이러한 이미지를 결합하여 세포-표면 수용체-리간드 상호 작용의 시공간 역학을 보여주는 고해상도 4차원 이미지인 z-스택을 형성합니다.

LLSM 수조에 물 10밀리리터와 플루오레세인 30마이크로리터를 추가합니다. 먼저 이미지(홈)를 눌러 물체를 이미지 위치로 이동하고 단일 용기 레이저 빔 패턴을 확인합니다.

가이드와 사전 설정된 관심 영역을 사용하여 레이저 빔을 정렬하여 빔을 모든 방향으로 균형을 이루는 얇은 패턴으로 만듭니다. 빔은 파인더 카메라에도 초점이 맞춰져 있어야 합니다. 두 개의 미러 틸트 조절기, 상단 초점 마이크로미터 및 대물렌즈 색상을 사용하여 빔을 조정합니다.

그런 다음 최소 200밀리리터의 물로 욕조와 대물렌즈를 씻어 플루오레세인을 완전히 제거합니다.

표준 형광 구슬을 이미지화하려면 'X Galvo Range' 상자에서 3으로 설정하여 디더를 켜고 라이브를 눌러 현재 필드를 봅니다. 가장 높은 회색 값을 위해 틸트 미러, 대물렌즈 색상 및 초점 마이크로미터를 수동으로 조정합니다. 그런 다음 대물렌즈 스캔, Z 갈보, Z 플러스 대물렌즈 및 샘플 스캔 캡처 모드에 적합한 패턴을 얻기 위해 필요에 따라 조정합니다. 그런 다음 샘플 스캔 모드에서 실행을 눌러 기울기 방지 및 디콘볼루션을 위한 샘플 포인트 확산 함수를 수집합니다. 레이저를 3색 모드로 변경하고 실행을 다시 누릅니다.

시작하려면 준비된 직경 5mm의 원형 커버슬립에 100,000개의 항원 제시 세포를 추가하고 10분 동안 침전시킵니다. 샘플 홀더에 그리스를 바르고 커버슬립을 셀 쪽이 위로 향하게 추가합니다.

그런 다음 커버슬립 뒷면에 이미징 미디어 한 방울을 추가합니다. 샘플 홀더를 압전에 나사로 고정하고 이미지(홈)를 누릅니다. 이미징할 항원 제시 세포를 찾고 LLSM 및 이미징 소프트웨어가 제대로 작동하는지 확인합니다.

라이브를 눌러 현재 이미지를 봅니다. Z를 따라 이동하여 커버슬립과 셀을 찾습니다. Z 방향으로 이동하여 항원 제시 세포의 중심을 찾은 다음 중지를 눌러 레이저를 일시 중지합니다. 3D를 확인하고 원하는 설정을 입력합니다. Enter 키를 누른 다음 Execute를 눌러 데이터를 수집합니다.

스테이지를 로드 위치로 내리고 커버슬립 바로 위에 이미징 배지에 50마이크로리터의 T 세포를 적하 단위로 추가합니다. 피펫 팁 끝에 방울이 생기도록 한 다음 팁을 목욕액에 대는 것이 가장 좋습니다. 이미지(Return)를 클릭하여 스테이지를 다시 올립니다.

이미징을 시작합니다. 원하는 Z-스택과 타임랩스 길이를 설정해야 합니다. 예를 들어, 0.4마이크로미터 스텝 크기에서 60개의 Z-스택을 이미지화하고 500번째 시간 프레임을 입력합니다. 광표백을 방지하기 위해 500프레임에 도달하기 전에 녹화를 중지하십시오. 라이브 모드를 사용하여 셀 쌍을 검색하고 준비가 되고 원하는 설정이 입력되면 실행을 눌러 데이터를 수집합니다.