뉴클레오솜 역학을 포착하기 위한 고속 타임랩스 원자력 현미경

진핵생물의 DNA 반복 단위인 뉴클레오솜은 히스톤 단백질 코어를 감싸는 DNA 세그먼트로 구성됩니다. 히스톤 코어 주위를 풀어주는 DNA는 뉴클레오솜 역학에 매우 중요합니다.

뉴클레오솜 역학을 포착하려면 원자력 현미경, AFM, 스캐너 스테이지에 장착된 매끄럽고 기능화된 운모 기판으로 시작합니다. 기질을 뉴클레오솜 함유 완충액으로 오버레이합니다.

음전하를 띤 뉴클레오솜 DNA는 기능화된 운모의 양전하와 상호 작용하여 표면에 고정됩니다. 뉴클레오솜이 과밀해지는 것을 방지하기 위해 고정된 운모 기질을 완충액으로 세척합니다.

뉴클레오솜 함유 스캐너 스테이지를 미리 장착된 캔틸레버가 포함된 이미징 챔버로 옮기고 팁은 가장자리에 있고 뉴클레오솜 쪽을 향하게 합니다.

챔버를 이미징 버퍼로 채웁니다. 정확한 편향 측정을 보장하기 위해 레이저 빔을 캔틸레버 뒷면에 정렬합니다.

AFM 팁은 완전히 감싼 뉴클레오솜 가까이에서 진동하고 표면을 스캔하여 일정한 간격으로 뉴클레오솜의 높이를 측정합니다.

발적인 DNA 풀림은 뉴클레오솜 높이를 증가시켜 팁의 진동을 번갈아 가며 캔틸레버 편향을 초래합니다. 이 캔틸레버 편향은 반사 된 레이저 빔 위치를 이동시키며, 이는 위치 민감 검출기에 의해 감지되고 지형 뉴클레오솜 이미지를 생성합니다.

AFM 이미지에서 히스톤 코어는 시간이 지남에 따라 높이가 증가하는 포장되지 않은 DNA가 있는 빛나는 얼룩으로 나타나 뉴클레오솜 역학을 나타냅니다.

유리 막대 스캐너 접착제를 사용하여 유리 막대를 AFM 스캐너 스테이지에 부착합니다. 최소 10분 동안 건조시키십시오. 그동안 직경 1.5mm의 0.1mm 두께의 원형 운모 조각을 더 큰 운모 시트에서 펀칭하여 만듭니다. 고속 AFM 운모 유리 막대 접착제를 사용하여 이 운모 조각을 고속 AFM의 유리 막대에 부착하고 건조되는 동안 최소 10분 동안 손대지 않은 상태로 유지합니다.

그런 다음 테이프에 잘 절단된 층이 보일 때까지 감압 테이프를 사용하여 운모에서 층을 절단합니다. 다음으로, 50밀리몰 APS 스톡 1마이크로리터를 증류된 탈이온수 99마이크로리터에 희석하여 500마이크로몰 APS 용액을 만듭니다. 갓 절단된 운모 표면에 2.5마이크로리터의 용액을 증적하고 표면이 30분 동안 기능화되도록 합니다.

배양 후 3마이크로리터 헹굼을 적용하여 증류된 탈이온수로 운모를 여러 번 헹굽니다. 헹굼할 때마다 운모 가장자리에 부직포 물티슈를 놓아 물을 완전히 제거합니다. 최종 헹굼 후 3마이크로리터의 증류된 탈이온수를 표면에 놓고 최소 5분 동안 그대로 두어 특이적으로 결합되지 않은 APS를 제거합니다.

그런 다음 프로브를 고속 AFM 홀더에 놓고 팁이 위를 향하도록 AFM 스테이지에 홀더를 배치합니다. 100마이크로리터의 증류된 탈이온수를 사용하여 홀더를 헹구고 0.22미크론 여과된 뉴클레오솜 이미징 완충액을 100마이크로리터 헹구는 다음 두 번 헹굽니다. 헹굼이 완료되면 챔버에 100마이크로리터의 뉴클레오솜 이미징 완충액을 채우고 팁을 담급니다.

레이저에 부딪힐 때까지 캔틸레버 위치를 조정합니다. 그런 다음 린스당 4마이크로리터를 사용하여 여과된 뉴클레오솜 이미징 완충액으로 APS-운모를 5회 헹굽니다. 1 나노몰의 최종 뉴클레오솜 농도를 위해 1 마이크로리터의 뉴클레오솜 어셈블리 스톡을 250 마이크로리터의 여과된 뉴클레오솜 이미징 완충액으로 희석합니다.

이 희석액 2.5마이크로리터를 표면에 묻히고 2분 동안 그대로 둡니다. 과밀을 피하기 위해 4마이크로리터의 뉴클레오솜 이미징 완충액으로 표면을 두 번 헹굽니다. 최종 헹굼 후 표면을 이미징 완충액으로 덮습니다. 스캐너와 샘플을 팁 홀더 위에 놓아 샘플이 뒤집히도록 합니다.

접근을 시작하려면 자유 진동 진폭에 가까운 설정점 진폭으로 자동 접근 기능을 사용하십시오. 표면이 잘 추적될 때까지 설정점을 조정합니다. 그런 다음 이미징 프레임당 약 300밀리초의 데이터 획득 속도로 약 150 x 150 나노미터의 이미지 영역을 200 x 200 나노미터로 설정합니다.