DNA와 단백질의 상호작용을 연구하기 위한 원이색성 분광법(Circular Dichroism Spectroscopy) 기법

ATP 의존성 염색질 리모델링 단백질은 ATP 의존적 방식으로 DNA 형태를 변경하여 촘촘하게 채워진 염색질의 유전자 발현을 조절합니다.

원형 이색성 또는 CD 분광법을 사용하여 염색질 리모델링제-DNA 상호 작용을 연구하려면 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 용액을 사용합니다. 올리고뉴클레오티드를 가열하여 변성시키고 얼음 위에 놓습니다.

빠른 냉각은 DNA를 재회하는 동시에 2차 구조를 형성합니다. 이중 가닥에서 단일 가닥 전이 영역은 염색질 리모델러를 위한 최적의 결합 부위를 제공합니다.

열식된 DNA를 큐벳에 첨가합니다. ATP 의존성 염색질 리모델링제, ATP 및 마그네슘 이온을 포함하는 완충액을 추가합니다.

리모델링자는 DNA에 결합한 다음 마그네슘 이온 복합체 ATP가 단백질에 결합하여 단백질을 활성화합니다. 활성화된 리모델링제는 ATP를 가수분해하여 DNA의 줄기 루프 형태를 유도합니다.

90° 위상차가 있는 좌우 원형 편광을 샘플을 통과시킵니다. 광학적으로 키랄 DNA는 왼쪽과 오른쪽의 원형 편광을 서로 다른 정도로 흡수합니다.

원형 이색성이라고 하는 차등 흡수는 투과된 빛이 타원으로 편광되는 결과를 초래하며, 이는 타원도로 측정됩니다. CD 스펙트럼의 특정 파장에서 두 개의 양의 피크는 줄기 루프 구조를 확인합니다.

EDTA를 첨가하여 마그네슘 이온을 킬레이트화하여 ATPase 활성을 억제합니다.

킬레이트화 시 CD 스펙트럼의 변화(특정 파장에서 음의 피크와 넓은 양의 피크를 나타냄)는 ATP 가수분해가 없는 상태에서 줄기 루프 형태의 파괴를 나타냅니다.

고투명도 석영 큐벳에서 CD 스펙트럼을 수집합니다. 직사각형 또는 원통형 큐벳을 사용하십시오. 큐벳을 세척하려면 물로 여러 번 세척한 다음 큐벳의 물이나 완충액을 스캔하여 깨끗한지 확인하십시오.

반응에는 PAGE 정제된 DNA 올리고뉴클레오티드를 사용합니다. 급속 냉각을 위해 가열 블록에서 DNA를 섭씨 94도에서 3분 동안 가열한 후 즉시 얼음 위에서 식힙니다. 천천히 냉각하려면 DNA를 섭씨 94도에서 3분 동안 가열한 후 분당 섭씨 1도의 속도로 실온으로 냉각시킵니다.

기본 스펙트럼을 기록하려면 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 총 5개의 제어 반응을 하나씩 설정합니다. 모든 반응에서 반응량을 300마이크로리터로 유지하십시오.

CD 스펙트럼을 기록하려면 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 총 5개의 실험 반응을 하나씩 설정합니다.

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