특정 항원을 검출하기 위한 Raman 분광법 기반 직접 면역분석

리포터가 나노입자에 결합할 수 있도록 라만 리포터 염료 분자를 금 나노입자와 함께 배양하는 것으로 시작합니다.

표적 항원에 특이적인 PEG 접합 항체인 폴리에틸렌 글리콜을 첨가합니다. 항체는 금-이황화물 결합을 통해 나노입자에 공유 결합합니다. 티올 접합 PEG를 첨가하여 나머지 나노입자 부위를 차단하고 나노입자 응집을 방지하여 나노입자 프로브를 형성합니다.

면역분석 플레이트 웰을 표적 항원으로 코팅합니다. 단백질이 포함된 용액으로 나머지 플레이트 부위를 차단합니다. 나노입자 프로브를 추가합니다. 웰 전체에서 연속 프로브 희석을 수행합니다. 프로브의 항체가 항원에 결합하여 복합체를 형성하도록 배양합니다.

라만 현미경을 사용하여 프로브의 광학 반응을 결정합니다. 입사 단색 레이저는 금 나노입자의 표면 전자를 여기시켜 진동을 일으켜 프로브 표면에 높은 국부 전자기장을 생성합니다.

입사 빔과 라만 리포터는 상호 작용하여 향상된 전자기장으로 인해 파장과 주파수가 다른 비탄성광 또는 라만 산란을 유발합니다. 비탄성적으로 방출된 라만 신호는 라만 스펙트럼을 생성하는 데 사용됩니다.

프로브 농도에 대해 라만 리포터 피크의 스펙트럼 영역을 플로팅하여 프로브 검출의 하한을 찾고 항원의 보다 민감한 검출을 용이하게 합니다.

라만 프로브를 준비하기 위해, 먼저 두 개의 1.5밀리리터 배치의 금 나노입자와 라만 리포터를 첨부된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 결정된 농도로 만든다.

이는 라만 리포터와 금 나노입자 용액을 결합하고 실온에서 30분 이상 결합하도록 함으로써 수행됩니다. 그런 다음 PEG화된 항체 용액을 리포터 결합 금 나노입자 용액 중 하나에 첨가하여 입자에 대한 항체 비율을 200:1로 만듭니다. 이 솔루션은 테스트 샘플을 위한 것입니다.

별도의 미세 원심분리 튜브에서 대조군으로 사용할 항원 대 입자의 200 대 1 비율로 다른 리포터 결합 금 나노입자 용액에 PEG화 항원을 추가합니다. 두 용액을 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 나노입자 표면의 나머지 부위를 차단합니다. 이를 달성하려면 먼저 HPLC 물을 사용하여 고체 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 티올을 200마이크로몰 농도로 용해시킵니다. 티올이 완전히 용해될 때까지 용액을 소용돌이치십시오. 그런 다음 티올 용액을 나노입자 결합 PEG-항체 용액에 40,000 대 1 비율로 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 금 나노입자의 나머지 부위가 차단

다음으로, 상청액이 투명해지도록 저결합 원심분리 튜브에서 입자를 원심분리하여 기능화된 라만 프로브를 회수합니다. 피펫팅으로 상청액을 제거하되 나노입자를 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 나노입자를 PBS 1밀리리터로 재현탁합니다.

약 3마이크로리터의 용액에서 UV-Visible 측정을 수행하여 금 나노입자 농도를 추정하고 이는 선형 관계이므로 알려진 금 나노입자 농도의 결과와 비교합니다.

나노입자가 충분히 차단되지 않으면 입자 간 접착력으로 인해 응집되어 시약이 잘못된 농도로 첨가되었음을 시사합니다. 일반적으로 용액은 짙은 빨간색이지만 응집하면 회색 색조가 생성됩니다.

최종 용액이 밀리리터당 최소 1 x 10¹¹ 입자가 되도록 부피를 조정하고 면역분석 플레이트를 기능화하는 데 사용될 때까지 용액을 섭씨 4도에서 보관합니다. 일주일 이내에 이러한 솔루션을 사용하십시오. 먼저 폴리스티렌 우물을 채울 수 있을 만큼 희석된 항원을 충분히 준비합니다. 그런 다음 용액을 소용돌이치고 즉시 용액을 플레이트 웰에 추가합니다.

항원이 실온에서 1시간 동안 플레이트에 결합하도록 합니다. 그런 다음 용액을 버리고 종이 타월로 덮인 탁상에 접시를 부딪쳐 과도한 항원 용액을 제거합니다. 표면을 씻기 위해 우물에 TBST를 추가합니다. 그런 다음 용액을 다시 버리고 종이 타월로 덮인 탁상에 접시를 부딪혀 세척제를 제거합니다.

다음으로, 플레이트의 각 웰에 70마이크로리터의 HSA 차단 용액을 첨가하고 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양하여 비특이적 결합을 방지하기 위해 플레이트의 나머지 결합 부위를 차단합니다. 그런 다음 차단 용액을 제거하고 이전에 설명한 대로 TBST로 플레이트를 세 번 헹굽니다. 최종 헹굼을 제거한 후 접시를 덮고 더 사용할 때까지 섭씨 4도에서 건조하게 보관하십시오.

이전에 준비된 프로브 나노입자 140마이크로리터를 96웰 플레이트의 첫 번째 열에 추가하고, 테스트 나노입자를 처음 5줄에, 대조군 나노입자를 마지막 3줄에 배치합니다. 다른 모든 컬럼에 70마이크로리터의 PBS를 추가합니다.

1-2 연속 희석을 사용하여 각 컬럼을 희석합니다. 첫 번째 열에서 70마이크로리터를 가져와 두 번째 열과 혼합하여 시작합니다. 그런 다음 두 번째 열에서 70마이크로리터를 가져와 세 번째 열에 추가하는 식입니다. 플레이트를 최소 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 결합되지 않은 나노입자 프로브를 제거하고 이전에 시연한 대로 TBST로 플레이트를 5회 세척합니다. 최종 세척 후 각 웰에 70마이크로리터의 PBS를 추가하고 플레이트를 플레이트 씰로 덮습니다. 대조군 샘플이 깨끗한지 확인하십시오. 비특이적 결합이 발생한 경우 대조군 샘플은 테스트 샘플과 유사한 색상을 갖습니다.

거꾸로 된 라만 현미경을 사용하여 금 나노입자 프로브가 있는 우물 표면에 대물렌즈의 초점을 맞춥니다. 우물의 라만 스펙트럼을 얻습니다. 1800 역센티미터에서 400역센티미터 범위의 스펙트럼을 수집하고 각 웰에 대해 이를 반복합니다. 마지막으로 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 마지막 섹션에 있는 단계에 따라 설정의 민감도를 결정합니다.