Name: Mycoplasma의 최적화된 PCR 기반의 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 배우세요 세포 배양에서 마이코플라스마 오염을 PCR로 검출하는 최적화된 방법을. 샘플 준비, 온도 사이클링, 아가로즈 겔 전기영동을 통해 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

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시그마 - 알드리치에 의해 투자

1. Mycoplasma 검출 <ol><li> 세포 배양 supernatants 직접 테스트하거나 예제는 나중에 사용하기 위해 준비하실 수 있습니다. 을 준비하기 위해 나중에 95에 살균 증폭 관과 부화에 뜨는 대신 100 μl를 사용 ° C 5 분. 일단 이것은 샘플이 최대 일주일 동안 2-8 ° C에 저장할 수 있습니다 완료됩니다. 직전 펠렛에 샘플 간단히 원심 분리기 (5 초) 모든 세포 파편을 실행합니다. </li><li> PCR에 대한 샘플을 준비하려면, 그 반응에 필요한 Jumpstart는 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 / rehydration 버퍼의 전체 볼륨을 결정합니다. 우리가 5 총 반응을 준비할 것이다. 다섯 번째 반응은 DNA 형성 촉매의 2.5μl 및 rehydration 버퍼의 114.5μl 필요합니다. 이것은 반응 및 시료 반응과 긍정적인 컨트롤에 대한 부정적인 제어 플러스 rehydration 버퍼의 24.5μl 당 rehydration 버퍼의 22.5μl 당 DNA 형성 촉매 중 하나 단위의 최소 포함됩니다. 반응마다의 DNA 중합 효소의 1 단위는 rehydration 버퍼의 해당 볼륨에 추가되어 있어야합니다. 이것이 사용되는 DNA 형성 촉매에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 깨끗한 microcentrifuge 관에 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 계산된 볼륨을 놓고 rehydration 버퍼의 계산 볼륨하십시오. 의 DNA 중합 효소 / rehydration 버퍼는 튜브를 flicking하여 부드럽게 혼합한다. 이 혼합물은 vortexed해서는 안됩니다. </li><li> 부정적인 제어를 준비하고 샘플 키트에 제공된 투명한 반응 튜브를 사용합니다. 키트에 제공된 반응 튜브는 이미 nuclueotides, primers 및 내부 제어 DNA가 포함되어 있습니다. 로 이전 단계에서 준비 Jumpstart는 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 / Rehydration 버퍼 믹스, 23 μl는 부정적인 제어 및 샘플 튜브의 각에 배치해야합니다. 부정적인 제어 DNA 무료로 물 2 μl를 추가하여 샘플 튜브 및 라벨의 각 샘플 2 μl를 추가합니다. 튜브를 flicking하여 내용을 섞는다. 내용은 vortexed해서는 안됩니다. </li><li> 준비하는 긍정적인 컨트롤은 키트에 제공된 핑크 반응 튜브를 사용합니다. 키트에 제공된 반응 튜브는 이미 nuclueotides, primers 및 내부 제어 DNA가 포함되어 있습니다. 반응 튜브 및 레이블로 이전 단계에서 준비 Jumpstart는 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 / Rehydration 버퍼 혼합 25 μl를 추가합니다. 튜브를 flicking하여 내용을 섞는다. 내용은 vortexed해서는 안됩니다. 대조군, 5 분 실온에서 긍정적인 제어 및 샘플 튜브를 품어. </li><li> PCR이 이루어 수있는 샘플은 열 자전거 타는 사람에 배치해야합니다. Jumpstart는 DNA 형성 촉매를 사용하면 정품 인증 단계는 필요하지 않습니다. 열 자전거 타는 사람의 반응 튜브를 놓습니다. 주기는 다음과 같이 설정되어야합니다 : 94 ° 30 초 동안 C, 55 ° 30 초 40초 72도 ° C에 대한 C. 이러한주기는 40 번 실행됩니다. </li><li> PCR주기가 완료되면 샘플은 열 자전거 타는 사람에서 그들을 제거하고 얼음에 그들을 배치하여 4-8 ° C로 냉각해야합니다. 샘플 냉각있을 때 그들은 전기에 대한 아가로 오스 겔에로드해야합니다. 그들은 이미 반응 튜브에 존재로서 로딩 젤 및 염료는 필요하지 않습니다. 직접 별도의 차선으로 각 PCR 8 μl를로드합니다. 3.0 cm - 2.5 마이 그 레이션 후 전기를 중지합니다. </li></ol> 2. 대표 결과 대조군은 약 481 BP에서 밴드를 표시해야합니다. 이것은 비디오의 시작 부분에 표시되는 전기 영동 젤에 대한 부정적인 컨트롤 열에 볼 수 있습니다. 481 BP의 부정적인 제어 밴드의 부재는 효소의 활동이 sufficienttaq만큼 민감한 아니었 사용되지 않았음을 좋은 지표입니다. Mycoplasma 긍정적인 샘플 270의 범위에서 밴드 ± 8 BP를 표시합니다. 밴드는 고도로 오염된 샘플 무겁고 가벼운 오염 샘플 희미합니다. 강도의 차이는 비디오의 시작 부분에 표시되는 전기 영동 젤에 긍정적인 샘플 열에 볼 수 있습니다. 모든 샘플은 PCR이 예상대로 발생는 것을 입증하는 내부 대조군을 포함합니다. 그것은 매우 오염된 샘플에 대한 내부 통제의 부재를보고 정상입니다. 샘플에 대한 부정적인 범위에서 긍정적인 범위 또는 밴드에서 밴드가 없다면 이것은 샘플 저해하는 좋은 지표입니다. 샘플을 저해하는 경우 PCR 억제제는 DNA 추출을 수행하여 제거할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg"> . 그림 1 관련 Amplicon 밴드 : PCR에 의해 mycoplasma 검출 결과가 표시됩니다. 레인 2는 약 481 BP에서 밴드를 표시해야 대조군입니다. 481 BP의 부정적인 제어 밴드의 부재는 DNA 형성 촉매 사용이 충분 구분하지다고 좋은 지표입니다. Mycoplasma - 긍정적인 샘플 270의 범위에서 밴드를 표시합니다 +로 차선 3과 같이 8 BP - 6. 밴드 hea 것입니다VY 매우 오염된 시료 (레인 6)와 가볍게 오염된 시료 (레인 4)을 위해 만들어졌습니다. 모든 샘플은 PCR이 예상대로 발생는 것을 입증하는 내부 대조군 (481 BP)를 포함하고 있습니다. 그것은 매우 오염된 샘플에 대한 내부 통제의 부재를보고 정상입니다.

<ol><li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+%28PCR%29+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li>
<li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+%28NAT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li>
<li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics%3A+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li>
</ol>

저자는이 문서에서 사용하는 시약 및 도구를 제작 시그마 - 알드리치의 직원입니다.

때문에 키트의 극단적인 감성, 정확하게 수행하면 키트 샘플은 mycoplasma 오염을 가지고 있는지 여부를 나타내는 정확한 결과를 얻을 수 있습니다. 키트의 Jumpstart DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 함께 사용하기위한 최적화되었습니다. 기타 taqs는 샘플을 준비할 때 사용할 수 있지만 481 BP의 내부 통제 밴드는 대체 DNA 형성 촉매의 적절한 민감도를 나타내기 위해 존재해야합니다. 긍정적인 밴드가 오염의 수준에 따라 다양한 밀도를 전시하는 것은이 가능합니다. 많이 오염된 샘플에 대한 내부 통제 대역의 부재를 관찰하는 것이 가능합니다. 오염을 방지하기 위해 샘플을 준비 때는 주의해야하며 적절한 기술을 사용하면 적절한위한 열쇠입니다. 룩아웃 Mycoplasma PCR 감지 키트를 사용하여 감지.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 룩아웃 Mycoplasma PCR 감지 키트 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> Jumpstart를 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> GenElute 혈액 게놈의 DNA 키트 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> Nunc 증폭 튜브 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

mycoplasma의 최적화된 pcr 기반의 감지

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

오염없는 세포 라인의 유지 보수 세포 기반 연구하는 것이 필수적입니다. 가장 큰 오염 문제 중 mycoplasma 오염 수 있습니다. 일반적으로 오염된 세포를 mycoplasma 죽이지 아니지만, 그들이 감지하기 어려울 수 있으며 변경 신진 대사를 포함하여 교양 세포에 효과 다양한 발생할 수, 증식 및 염색체 aberrations가 둔화. 즉, mycoplasma 오염은 생명 과학 연구에 대한 정확한 자료를 제공하는 이들 세포 라인의 가치를 타협. 실험실에서 mycoplasma 오염의 원인은 매우 완벽하게 제어하는​​ 도전입니다. 특정 mycoplasma 수종은 인간의 피부에 발견으로, 그들은 가난한 무균 기술을 통해 도입하실 수 있습니다. 또한, 그들은 이러한 태아 소 혈청으로 오염된 보충제에서 온 수 있으며, 가장 중요한 기타 오염된 세포 문화. 일단 mycoplasma가 문화를 오염, 빨리 연구실의 다른 영역을 오염으로 확산될 수 있습니다. 좋은 무균 기술로 좋은 실험실 관행에 엄격한 준수가 핵심이며, mycoplasma에 대한 정기 검사는 높은 mycoplasma 오염의 성공적인 제어를위한 권장합니다. mycoplasma의 PCR 기반의 감지는 일상적인 세포 라인 유지 보수를 위해 매우 인기있는 방법이되었습니다. PCR 기반의 탐지 방법은 매우 민감하고 연구자들이 미생물 기술을 사용하여 필요한 그것이 시간에 비해 감지되면 오염을 분리 및 제거에 신속하게 대응할 수 있도록 신속한 결과를 제공할 수 있습니다. 룩아웃 Mycoplasma PCR 탐지 키트 μl 당 겨우 2 genomes의 검출 한도, 매우 민감합니다. 매우 구체적인 Jumpstart는 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 독점적인 프라이머 설계의 이점 복용, 잘못된 반응을 획기적으로 줄일 수 있습니다. 편리한 8 튜브 형식은, dNTPs 사전 - 코팅 및 관련 primers 스트립은 세포 라인의 큰 컬렉션과 함께 고객의 요구를 충족하기 위해 처리량을 높일 수 있습니다. 키트의 극단적인 감도 감안할 때, 큰주의가 샘플 및 시약의 실수로 오염을 방지하기 위해 이동해야합니다. 우리가 보여주는 단계별로 프로토콜은 신뢰할 수있는 mycoplasma 감지에 필요한주의 사항과 관행을 강조 표시합니다. 우리는 또한 표시하고 전형적인 결과와 자신의 해석을 논의합니다. 우리의 목표는 룩아웃 Mycoplasma PCR 감지 키트를 사용하여 연구의 성공을 보장하는 것입니다.

룩아웃 Mycoplasma PCR 탐지 키트는 세포 문화와 생체를 파생 다른 세포 배양에서 Mycoplasma Acholeplasma, 그리고 Ureaplasma 오염의 검출에 높은 민감도에 대한 선택의 방법으로 설립되는 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 사용합니다.

Mycoplasma의 최적화된 PCR 기반의 감지

오염되지 않은 세포주를 유지하는 것은 세포 기반 연구에 있어 필수적입니다. 가장 우려되는 오염원 중 하나는 마이코플라스마 오염입니다. ...

본 절차의 전체적인 목적은 마이코플라스마 오염 검출에 최적화된 lookout mycoplasma PCR 검출 키트의 사용 단계를 시각적으로 보여주는 것입니다. 우선, 원하는 템플릿을 PCR에 부적합하게 만들 수 있는 DNA 분자들을 불활성화하기 위해 샘플을 95 °C로 가열합니다. 그 다음, 뉴클레오타이드, 프라이머 및 내부 대조군 DNA가 미리 코딩된 제공된 튜브를 사용하여 PCR용 샘플을 준비합니다.절차의 세 번째 단계는 최대의 민감도를 확보하고 비특이적 증폭을 제거하기 위해 세심하게 최적화된 조건 하에서 온도 사이클링을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 아가로스 겔 전기영동 평가를 통해 해당 샘플이 마이코플라스마에 오염되었는지 여부를 결정하는 결과를 얻을 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 시약이 미리 준비되어 있으며 고품질의 PCR 튜브를 사용한다는 점입니다.이를 통해 더욱 편리하고 효율적인 작업이 가능합니다. 이 키트의 또 다른 장점은 샘플 µL당 2개 미만의 mycoplasma 게놈만으로도 오염을 검출할 수 있다는 점입니다. mycoplasma 검출 절차를 수행할 때는 피부 노출을 최소화하기 위해 적절한 개인 보호 장비를 착용하고, 사용하는 모든 시약에 오염이 없는지 확인하며, 항상 적절한 무균 조작법을 유지하여 가능한 모든 오염을 방지하는 것이 중요합니다.이 절차는 세포 배양 상층액에서 직접 수행하거나, 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 미리 준비하여 수행할 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 샘플을 준비하려면 각 상층액 100 µL를 멸균 증폭 튜브에 넣고 95 °C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플은 2 ~ 8 °C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다.시료를 테스트하기 직전에, 세포 잔해물을 가라앉히기 위해 짧게 원심분리합니다. PCR 시료를 준비하려면, 먼저 반응에 필요한 DNA polymerase 재수화 버퍼의 총 부피를 결정하십시오. 반응당 1단위의 DNA polymerase를 적절한 부피의 재수화 버퍼에 첨가해야 하며, 이 부피는 사용되는 tac에 따라 달라집니다. 본 시연에서는 jumpstart TAC D 93 0 7이 5회 반응(시료 3개, 양성 대조군 1개, 음성 대조군 1개)에 사용됩니다.계산된 부피의 DNA polymerase를 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, 이어서 계산된 부피의 rehydration buffer를 추가합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 DNA polymerase rehydration buffer를 부드럽게 섞어줍니다. 이 혼합물을 볼텍싱하지 마십시오.키트에 제공된 투명 반응 튜브를 사용하여 음성 대조군과 시료를 준비하십시오. 이 반응 튜브에는 이미 뉴클레오타이드, 프라이머 및 내부 대조군 DNA가 포함되어 있습니다. 이전에 준비한 DNA polymerase 재수화 버퍼 23 µL를 분주하십시오. 음성 대조군 튜브와 각 시료 튜브를 혼합하십시오.그런 다음 음성 대조군에는 2 µL의 DNA free water를 추가하고, 각 시료 튜브에는 각 시료 2 µL를 추가합니다. 튜브를 톡톡 쳐서 내용물을 혼합합니다. 내용물을 vortex해서는 안 됩니다.양성 대조군을 준비하려면 키트에 제공된 분홍색 반응 튜브를 사용하십시오. 이 반응 튜브에는 이미 뉴클레오타이드, 프라이머 및 내부 대조군 DNA가 포함되어 있으며, 반응 튜브에 25 µL의 DNA polymerase 재수화 버퍼 믹스를 첨가합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 내용물을 혼합하되, 볼텍싱해서는 안 됩니다.그 다음 양성 대조군, 음성 대조군 및 샘플 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 모든 반응 튜브를 열 순환기(thermal cycler)로 옮깁니다. PCR을 위해 다음 조건으로 40 사이클을 설정합니다.94 °C에서 30초 동안 반응시킵니다. 55 °C에서 30초, 72 °C에서 40초 동안 반응시킵니다. Jumpstart tack을 사용하는 경우 활성화 단계는 필요하지 않습니다.PCR 사이클이 완료되면, 샘플을 서멀 사이클러에서 꺼내 얼음 위에 올려 4~8 °C로 냉각합니다. 그 다음 샘플을 전기영동용 아가로스 겔에 로딩할 수 있으며, 각 PCR 반응액 8 µL를 별도의 웰에 직접 로딩합니다. 로딩 버퍼와 염료는 이미 반응 튜브에 포함되어 있으므로 샘플 로딩 전에 따로 추가할 필요가 없습니다.추적 염료가 2.5에서 3cm 정도 이동한 후 전기영동을 중단하십시오. PCR을 이용한 마이코플라스마 검출의 대표적인 결과가 이 아가로스 겔 레인 이미지에 나와 있습니다. 2번은 음성 대조군으로, 약 481 base pairs 위치에서 밴드가 나타나야 합니다.481 base pairs 위치에 음성 대조군 밴드가 나타나지 않은 것은 사용된 TAC의 민감도가 충분하지 않았음을 나타내는 지표입니다. Mycoplasma 양성 샘플은 레인 3에서 6에 표시된 것과 같이 270 ± 8 base pairs 범위에서 밴드가 나타납니다. 오염도가 높은 샘플의 경우 밴드가 진하게 나타나며, 오염도가 낮은 샘플의 경우 밴드가 희미하게 나타납니다.모든 샘플에는 PCR이 예상대로 진행되었음을 입증하기 위한 내부 음성 대조군이 포함되어 있습니다. 오염도가 매우 높은 샘플에서 내부 대조군이 나타나지 않는 것은 일반적인 현상입니다. 7번 레인에서 보이는 것과 같이 양성 및 음성 범위 모두에서 밴드가 나타나지 않는 것은 샘플의 반응이 억제되었음을 나타내는 좋은 지표입니다.샘플에 억제제가 포함된 경우, DNA 추출을 수행하여 PCR 억제제를 제거할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 키트 절차에 명시된 모든 필수 단계를 수행하는 방법은 물론, 결과 해석 및 필요 시 문제 해결 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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Mycoplasma의 최적화된 PCR 기반의 감지

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