Mycoplasma의 최적화된 PCR 기반의 감지

본 절차의 전체적인 목적은 마이코플라스마 오염 검출에 최적화된 lookout mycoplasma PCR 검출 키트의 사용 단계를 시각적으로 보여주는 것입니다. 우선, 원하는 템플릿을 PCR에 부적합하게 만들 수 있는 DNA 분자들을 불활성화하기 위해 샘플을 95 °C로 가열합니다. 그 다음, 뉴클레오타이드, 프라이머 및 내부 대조군 DNA가 미리 코딩된 제공된 튜브를 사용하여 PCR용 샘플을 준비합니다.

절차의 세 번째 단계는 최대의 민감도를 확보하고 비특이적 증폭을 제거하기 위해 세심하게 최적화된 조건 하에서 온도 사이클링을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 아가로스 겔 전기영동 평가를 통해 해당 샘플이 마이코플라스마에 오염되었는지 여부를 결정하는 결과를 얻을 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 시약이 미리 준비되어 있으며 고품질의 PCR 튜브를 사용한다는 점입니다.

이를 통해 더욱 편리하고 효율적인 작업이 가능합니다. 이 키트의 또 다른 장점은 샘플 µL당 2개 미만의 mycoplasma 게놈만으로도 오염을 검출할 수 있다는 점입니다. mycoplasma 검출 절차를 수행할 때는 피부 노출을 최소화하기 위해 적절한 개인 보호 장비를 착용하고, 사용하는 모든 시약에 오염이 없는지 확인하며, 항상 적절한 무균 조작법을 유지하여 가능한 모든 오염을 방지하는 것이 중요합니다.

이 절차는 세포 배양 상층액에서 직접 수행하거나, 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 미리 준비하여 수행할 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 샘플을 준비하려면 각 상층액 100 µL를 멸균 증폭 튜브에 넣고 95 °C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플은 2 ~ 8 °C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다.

시료를 테스트하기 직전에, 세포 잔해물을 가라앉히기 위해 짧게 원심분리합니다. PCR 시료를 준비하려면, 먼저 반응에 필요한 DNA polymerase 재수화 버퍼의 총 부피를 결정하십시오. 반응당 1단위의 DNA polymerase를 적절한 부피의 재수화 버퍼에 첨가해야 하며, 이 부피는 사용되는 tac에 따라 달라집니다. 본 시연에서는 jumpstart TAC D 93 0 7이 5회 반응(시료 3개, 양성 대조군 1개, 음성 대조군 1개)에 사용됩니다.

계산된 부피의 DNA polymerase를 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, 이어서 계산된 부피의 rehydration buffer를 추가합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 DNA polymerase rehydration buffer를 부드럽게 섞어줍니다. 이 혼합물을 볼텍싱하지 마십시오.

키트에 제공된 투명 반응 튜브를 사용하여 음성 대조군과 시료를 준비하십시오. 이 반응 튜브에는 이미 뉴클레오타이드, 프라이머 및 내부 대조군 DNA가 포함되어 있습니다. 이전에 준비한 DNA polymerase 재수화 버퍼 23 µL를 분주하십시오. 음성 대조군 튜브와 각 시료 튜브를 혼합하십시오.

그런 다음 음성 대조군에는 2 µL의 DNA free water를 추가하고, 각 시료 튜브에는 각 시료 2 µL를 추가합니다. 튜브를 톡톡 쳐서 내용물을 혼합합니다. 내용물을 vortex해서는 안 됩니다.

양성 대조군을 준비하려면 키트에 제공된 분홍색 반응 튜브를 사용하십시오. 이 반응 튜브에는 이미 뉴클레오타이드, 프라이머 및 내부 대조군 DNA가 포함되어 있으며, 반응 튜브에 25 µL의 DNA polymerase 재수화 버퍼 믹스를 첨가합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 내용물을 혼합하되, 볼텍싱해서는 안 됩니다.

그 다음 양성 대조군, 음성 대조군 및 샘플 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 모든 반응 튜브를 열 순환기(thermal cycler)로 옮깁니다. PCR을 위해 다음 조건으로 40 사이클을 설정합니다.

94 °C에서 30초 동안 반응시킵니다. 55 °C에서 30초, 72 °C에서 40초 동안 반응시킵니다. Jumpstart tack을 사용하는 경우 활성화 단계는 필요하지 않습니다.

PCR 사이클이 완료되면, 샘플을 서멀 사이클러에서 꺼내 얼음 위에 올려 4~8 °C로 냉각합니다. 그 다음 샘플을 전기영동용 아가로스 겔에 로딩할 수 있으며, 각 PCR 반응액 8 µL를 별도의 웰에 직접 로딩합니다. 로딩 버퍼와 염료는 이미 반응 튜브에 포함되어 있으므로 샘플 로딩 전에 따로 추가할 필요가 없습니다.

추적 염료가 2.5에서 3cm 정도 이동한 후 전기영동을 중단하십시오. PCR을 이용한 마이코플라스마 검출의 대표적인 결과가 이 아가로스 겔 레인 이미지에 나와 있습니다. 2번은 음성 대조군으로, 약 481 base pairs 위치에서 밴드가 나타나야 합니다.

481 base pairs 위치에 음성 대조군 밴드가 나타나지 않은 것은 사용된 TAC의 민감도가 충분하지 않았음을 나타내는 지표입니다. Mycoplasma 양성 샘플은 레인 3에서 6에 표시된 것과 같이 270 ± 8 base pairs 범위에서 밴드가 나타납니다. 오염도가 높은 샘플의 경우 밴드가 진하게 나타나며, 오염도가 낮은 샘플의 경우 밴드가 희미하게 나타납니다.

모든 샘플에는 PCR이 예상대로 진행되었음을 입증하기 위한 내부 음성 대조군이 포함되어 있습니다. 오염도가 매우 높은 샘플에서 내부 대조군이 나타나지 않는 것은 일반적인 현상입니다. 7번 레인에서 보이는 것과 같이 양성 및 음성 범위 모두에서 밴드가 나타나지 않는 것은 샘플의 반응이 억제되었음을 나타내는 좋은 지표입니다.

샘플에 억제제가 포함된 경우, DNA 추출을 수행하여 PCR 억제제를 제거할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 키트 절차에 명시된 모든 필수 단계를 수행하는 방법은 물론, 결과 해석 및 필요 시 문제 해결 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.