Name: 약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는 Dugesia /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 플라나리아 재생 분석을 통해 줄기세포 분화와 재생생물학을 연구하는 방법을 Dugesia japonica를 사용하여 약물 및 유전자 조작 기법을 적용합니다.

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실험실에서 작업은 NSF (MCB0919933)와 NIH (GM088790)에 의해 지원됩니다.

1. 트렁크의 조각 재생 분석 <ol><li> 동물 폐기물 및 섭취 식품 (~ 30 그대로 웜, 각 벌레 ~ 포스트 기아 길이 80~10mm) 무료입니다 보장하기 위해 재생 분석하기 전에 최소한 5 일 동안 벌레의 일대 먹이를 중지합니다. </li><li> 분석의 날, 물을 미리 냉동 파괴 얼음 접시를 씻어 및 플라스틱 포장으로 평면 아이스 표면을 커버. 포셉를 사용하여 플라스틱 랩에 하나의 필터 용지를 넣으십시오. </li><li> 물이 몇 방울로 필터 종이를 축축하게하다. 전송 피펫을 사용하여 필터 (필터마다 &lt;20 웜)에 planarians을 전송합니다. 웜 더 샘물과 repipetting하여 필요한 경우, 필터에 재배치 수 있습니다. 초과 액체를 제거합니다. </li><li> 메스를 사용하여 동물의 앞쪽에 정점과 인두 (그림 1A)의 앞쪽에 끝 사이의 약 절반을 만든 싱글 컷으로 머리를 절단. </li><li> 메스를 사용하여 약 절반 꼬리 동물의 종료와 인두 (그림 1A)의 후부 끝 사이에 만들어진 하나의 상처로 꼬리 지역을 절단. 절단 후 70 % 에탄올로 moistened 종이 타월을 사용하여 메스에 과도한 가래를 제거합니다. 메스에서 초과 에탄올을 닦아주십시오. </li><li> 샘물이 들어있는 페트리 접시 (100 X 25mm 깊이)에 집게를 통해 필터를 전송합니다. (상처의 봉합, 상처의 곤란과 고난으로 관찰할 수) ~ 3 분 동안 기다리십시오. </li><li> thermostatted 인큐베이터로 재생 분석 및 전송 (24 ° C)에 원하는 매체를 포함하는 페트리 접시에 여과지에서 간선 조각을 씻어. </li><li> 재생 구조는 (그림 1A) 확인할 수있다 ~ 1 주일 만에 점수가 재생 표현형. </li></ol> 2. praziquantel에 의해 유도된 bipolarity : 중생의 약리 조작 <ol><li> DMSO의 solubilizing 약물 (200mM 주식 1mL에 62.4mg PZQ)에 의해 praziquantel (PZQ) 재고를 준비합니다. 당일에 사용하십시오. </li><li> 버퍼 Montjuch 소금에서 마약이 포함된 솔루션 (90 μm의 PZQ)의 50mL를 확인합니다. 분산을 위해 ~ 1 분 와동. </li><li> [프로토콜 # 1] 최종 단계 [1.7]에서 PZQ에 트렁크 조각의 코호트를 노출, 위의 내용과 같은 트렁크 조각 재생 분석을 수행합니다. </li><li> 24-48시간 후, 교환 PZQ 함유, 샘물에 대한 미디어 웜 여러 (&gt; 3) 번 세척. </li><li> 인큐베이터에 벌레를 반환합니다. 점수 bipolarity (2 헤드, 그림 1B) 절단 후 일주. </li></ol> 3. 중생의 유전자 조작 : 생체내 RNAi 먹이 프로토콜 <ol><li> 이전 분석하기 위해 닭고기 간 homogenate를 준비합니다. foodstock에서 지방산, 노란색 컬러 섹션, 그리고 퓌레 나머지 간을 폐기하십시오. 저장 메쉬 스트레이너 및 나누어지는 서스펜션 (1.5mL 튜브, -20 ° C)를 통해 필터 퓌레. </li><li> 이전 분석하기 위해, -20 ° C.에 저장된, 1mL 샘플로 공급을 aliquoting하여 소 적혈구 (RBCs)를 준비 </li><li> RNAi에 대한 웜을 선택합니다. 세 동료가 사용됩니다 : 관심의 유전자, 긍정적인 제어 (알려진 RNAi의 표현형과 유전자, 그림 1C, D &amp; E)과 부정 제어 (NO RNAi의 표현형과 유전자, 실험 코호트에 비해 최저 수준의 평가에도 유용합니다.) 각 코호트 들어, ~ 250 벌레를 (최소한 5 일 굶어 후 긴 ~ 80~10mm)을 사용합니다. 플라스틱 욕조에 샘물에 보관하십시오. </li><li> 관심 dsRNA 대상으로 유전자를 표현 E. 대장균의 각 RNAi의 보병대, 해동 재고에 대한 [8], 닭고기 간 homogenate의 튜브와 함께 [3.1]와 RBCs의 튜브 [3.2]. </li><li> 펠렛 박테리아 (1만3천그램 1 분). 2xYT 미디어 (~ 700μl)에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다. 얼음 뜨는, 장소 펠렛을 삭제, Recentrifuge. </li><li> 팁의 끝을 잘라하여 큰 구멍 P200 피펫 팁을 만듭니다. 철저히 RNAi 수유 믹스를 만들 수 닭고기 간 homogenate (150 μL)와 RBCs (50 μL)의 혼합물에있는 박테리아 펠렛을 resuspend. 원심 분리하여 기포를 제거합니다. </li><li> 먹이를 들어, (~ 1 인치 깊이를 떠나) 벌레가 들어있는 플라스틱 욕조에서 물의 대부분을 제거합니다. 소용돌이 욕조는이 컨테이너의 중심에 벌레를 집중하고, 벌레를 corralling 원안에 피펫 RNAi의 먹이 혼합합니다. 신중하게 다른 식사를 perturbing 않고 RNAi의 먹이 혼합에 다시 escapees을 동축 케이블로 전송 피펫을 사용! </li><li> 수유 후 (~ 1 시간), 잘 공급되는 planarians를 확인합니다. 이 벌레는 섭취 RBCs에서 딥 레드 착색을 보여줍니다. 다른 사람을 폐기하십시오. </li><li> 신중하게, 신선한 샘물과 솔루션을 먹이 음식 egestion을 방지하기 위해 교란을 최소화 바꿉니다. 이렇게하려면 부드럽게 전송 피펫을 사용하여 튜브의 한쪽으로, 흐린 물을 부어하고, 조심스럽게 욕조의 반대편 벽을을 붓고 신선한 물로 교체 벌레를 집중. Resubmerge의 planarians 신속하게 공기에 장기간 노출로도 식품 egestion 결과. </li><li> 대충 SE앨 컨테이너 뚜껑과 인큐베이터로 돌아갑니다 (24 ° C) </li><li> 재생주기 [프로토콜 # 1] RNAi의 phenotypes에 대한 화면으로 함께 interspersed 여러 사이클을 통해 RNAi 먹이 프로토콜 (따로 ~ 2-3일)를 반복합니다. 많은 유전자에 대한 효과적인 이송 및 재생을위한 표준 프로토콜은 총 기간이 ~ 1 달 걸립니다 그림 2에 표시됩니다. </li></ol> 최적의 프로토콜과 같은 mRNA의 안정성, 조직 현지화, 단백질 perdurance, 또는 재생 후 여러 먹이주기 걸로 표현형의 개발과 같은 요인에 따라 달라집니다로, 다른 유전자에 대해이 제도를 수정합니다. 단순히 부정적인 제어 일대와 타겟 mRNA 수준을 비교하는 (명백한 경우) 표현형의 penetrance에 대한 심사 또는 qPCR의 방식에 의해 최저 수준을 평가합니다. 4. 대표 결과 : 트렁크 조각 재생 분석은 모든 벌레 정상 앞쪽에 - 후부 ( '꼬리에 머리') 극성을 재생성해야하는 등 강력합니다. 이것은 바로 앞쪽에 eyespots (asterixed, 그림 1A)의 출현에 의해 용이 절단 후 5 일,로 득점 수 있습니다. 그러나, 손실 구조의 완전한 형태학의 복원은 일주일 뒤에 발생합니다. 두 달린 벌레를 항복하는 PZQ하여 트렁크 조각 재생의 약리 조작 (그림 1B)가 또한 강력합니다 (EC 50 = 87 (+ -) 11 %의 바이폴라 조각 48 시간 20 70μM PZQ). Bipolarity 하나의 재생 사이클을 통해 발생합니다. 이러한 assays의 낮은 효율 가능성이 약물 용해도 및 / 또는 저장하거나, PZQ 안 먹힐 다른 flatworm 종의 사용 문제와 관련이 있습니다. 낮은 penetrance과 마약, anteriorization 지수는 종종 전체 bipolarity의 22 별도로 중간 phenotypes을 점수하는 데 사용됩니다. 긍정적인 제어 구조의 RNAi로 인한 Phenotypes는 그림 1에 표시됩니다 : 자포니카 Dugesia의 RNAi 여섯 1 (D J - 6 - 1) 눈이없는 표현형 23 일 (그림 1C), Dugesia 자포니카 PC2의 RNAi (DJ - PC2) 결과 빛이 싫다고 응답 24 (그림 1D)과 RNAi의 손실 결과 Dugesia 자포니카 βcatenin - 1 (DJ - βcatenin - 1) 트렁크 조각 (그림 1E)에서 두 개의 머리 표현형 16-19, 21을 초래합니다. 이러한 phenotypes은 다음 간단한 RNAi 프로토콜을 사용하여 얻을 수있다 : DJ - 6 - 1 (FFxFx), DJ - PC2 (FFFx), DJ - βcatenin - 1 (FFxFx) 어디 F = 먹이주기 및 X = 재생 사이클 각각. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1 :... 트렁크 조각 재생 분석 왼쪽, excised 트렁크 조각의 위치를 표시 planarian (위)와 개략도 (중간)의 이미지를 마우스 오른쪽, 트렁크 조각 재생의 timecourse이 표시된 시간에 재생 조각의 모양 (일) 보여주 B PZQ 노출에 의해 제작. 쌍두 planarian 이미지 DJ - 6 - 1 RNAi. 모바일 컨트롤 벌레에 비해 고정되어 DJ - PC2 RNAi 웜 (스테인드 적색)의 빛을 혐오 반응의 D 손실 (스테인드에 의해 만들어진 C '눈이없는'벌레 녹색). E 바이폴라 planarian는 DJ - βcatenin - 1 RNAi에 의해 만들어진. BE에서 RNAi 벌레의 원래 앞쪽에 끝이 왼쪽으로 지향합니다. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2 : D. 많은 유전자의 분해에 대한 효과가 여러 feedings로 구성된 전형적인 RNAi 프로토콜 (F) 및 재생 사이클 (X)에 대한주기를 먹이 및 절단의 순서 자포니카. 개별 유전자에 대해이 프로토콜의 변경은 사용하는 예를 들어, 최적의 결과를 얻을 필요가있을 수 있습니다 적은 (괄호) 또는 수유 및 재생 사이클의 큰 수입니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

프로토콜은 자포니카 planarian의 Dugesia의 재생을 연구하고 조작 여기 상세 assays을 설명했다. 그들은 간단하고 쉽게 실험실이나 교실에서 수행할 수있는 전문 장비가 이러한 요구하지 않습니다. Assays 개별적으로 수행하거나, 결합 (생체내에서 마약 efficacies의 화학 유전자 검사)와 후보 유전자 수준에서 수행할 수 있습니다, 또는 불편, 높은 처리량 검사 8 적응력이 아르 수 있습니다. 자신의 권리를 planarians의 흥미로운 생물학을 공부에 대한 여부, 또는 조직 재생을 연구에 대한 대안 모델의 포유 동물 homologues의 생체내 기능의 평가에 대한 이러한 접근 방식은 연구자의 ​​다양한에서 관심을 catalyze해야합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 공급 업체 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 스프링 워터 </td><td> Kandiyohi. 프리미엄 워터스 주 미니 애폴리스, MN </td><td> N / A </td><td> 샘물의 다른 형태도 잘 작동합니다. 생존의 assays의 첫 번째 시련. </td></tr><tr><td> NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM) : 1 x는 Montjuïch 소금을 버퍼. 24 산도 7.4 ° C. </td><td> 여러 공급 업체 </td><td> N / A </td><td> 산도 버퍼링을 보장하기 위해 재생 assays 동안 약물 치료를위한 인공 물. 8분의 5 Holtfreter의 솔루션은 대안입니다. </td></tr><tr><td> 2xYT 맛을 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP2467 - 500 </td><td> 미디어 = 31g / L. Autoclaved. </td></tr><tr><td> 페트리 접시 (100x25mm) </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 08-757-11 </td><td> 재생주기 동안 주택 웜 </td></tr><tr><td> 스퀘어 접시 (100x100x15mm) </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 08-757 - 11A </td><td> 벌레 절단 표면으로 사용 얼음 트레이를위한 물, 동결로 채우기 </td></tr><tr><td> 플라스틱 욕조 : Ziploc 트위스트 &#39;N은 Loc (16온스). </td><td> 다양한 소매 </td><td> N / A </td><td> RNAi의 동료를위한 편리한 물을 꽉 용기 </td></tr><tr><td> 치킨 간 </td><td> 상업 식료품 </td><td> N / A </td><td> 항생제의 소지를 없애기 위해 때문에 유기 공급을 향해 편견. </td></tr><tr><td> 핸드 블렌더 </td><td> 모든 부엌 공급 </td><td> N / A </td><td> 닭고기 간 퓨레를 만들기위한 사용 </td></tr><tr><td> 와이어 1mm 메쉬 스트레이너 </td><td> 모든 부엌 공급 </td><td> N / A </td><td> 닭고기 간 퓨레를 긴장에 사용 </td></tr><tr><td> 보빈 적혈구 </td><td> Lampire 생물학 연구소 </td><td> 7,240,807 </td><td> 백퍼센트 RBC 서스펜션을 씻었 풀링 </td></tr><tr><td> 서큘러 여과지 </td><td> 왓먼 # 3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td> 전송 피펫 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균, 수술 블레이드 </td><td> 여러 공급 업체 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> ± Praziquantel </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> P4668 </td><td> 4 어둠 속에 저장 파우더 aliquots ° C. 마르다. </td></tr><tr><td> DJ - 6 - 1 </td><td></td><td> GenBank AJ557022.1 </td><td> &quot;눈을 이하&quot;표현형 23 RNAi 긍정적인 제어 </td></tr><tr><td> DJ - βcatenin - 1 </td><td></td><td> GenBank AB181913.1 </td><td> 두 머리 표현형 17 RNAi 긍정적인 제어 </td></tr><tr><td> DJ - PC2 </td><td></td><td></td><td> 가벼운 혐오의 표현형 24 손실 RNAi 긍정적인 제어 </td></tr></tbody></table>

약리 및 기능성 유전자 assays은 planarian의 재생을 조작하는<em자포니카> dugesia</em

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

자유 생활 planarian의 flatworms 자신의 뛰어난 재생 능력을 1로 실험적인 사용 때문에 오랜 역사를 가지고. 이 동물에서 excised 작은 조각이 없거나 신체 구조의 재생 다음 원래 신체 계획을 개혁. &#39;트렁크&#39;조각이 손상 웜으로부터자를 경우 예를 들어, 새 &#39;머리&#39;anteriorly 재생되며, &#39;꼬리&#39;는 (그림 절단하기 전에 원래의 신체 구조의 &#39;머리 - 투 - 꼬리&#39;극성을 복원 뒤로 재생성합니다 1A). 재생 정상 신체 항상성 및 집행 조직 재생 중에 ~ 30 서로 다른 세포 유형으로 차별 &#39;neoblasts&#39;로 알려진 planarian 줄기 세포에 의해 구동됩니다. 이 재생 과정은 강력하고 입증하기 쉽습니다. 여러 선구 실험실, 다양한 도구와 기능 유전 방법의 헌신에 때문에 지금은이 모델을 시스템에 최적화된되었습니다. 따라서, 상당한 최근의 진전은 planarian 발달 소성 2-9을 underpinning 분자 이벤트를 이해하고 조작하였습니다. planarian 모델 시스템은 과학자들의 광범위한 관심을 것입니다. neuroscientists 들어, 모델은 전체 신경계의 재생을 연구보다는 단순히 regrowth / 일반적으로 많이 설립 모델에 연구의 초점 아르 단일 신경 세포 프로세스의 복구합니다. 수있는 기회를 내실수 Planarians는 신경 전달 물질 10 과다을 표현 중추 신경계 11, 12의 진화를 연구를위한 중요한 시스템을 대표하고 행동 선별 가능성 13, 14 있습니다. 재생 결과는 약리 및 유전자 조작에 의해 apparoaches 의무가 있습니다. 예를 들어, 약물 단순히 몸과 조각을 배치 약물이 포함된 절단 후 다른 시간 지점에서 솔루션을하여 재생에 대한 효과에 대한 심사 수 있습니다. 개별 유전자의 역할은 microinjection의 사이클이나 dsRNA 구조 8, 9, 15 bacterially - 표현 이송을 통해 얻을 수있는 최저의 방법을 (생체내 RNAi)를 이용하여 공부하실 수 있습니다. 두 방식은 바이폴라 동물 16-21 높은 penetrance - 예를 들어, 재생시 시각적으로 눈에 띄는 phenotypes를 만들 수 있습니다. 이 모델과 같은 방법을 구현 채택을 촉진하기 위하여, 우리는 planarian의 Dugesia가 자포니카 사용 약리 및 유전 assays (생체내 RNAi의 먹이에 의해)이 동영상 기사 프로토콜의 쇼케이스.

살아있는 동물 이내에 줄기 세포 차별을 공부에 대한 매력적인 모델은 planarian의 flatworm입니다. 재생 쉽게 기본적인 실험실에서 수행하는 간단한 절단 실험에서 공부하고 약리 및 유전 (의무뿐입니다<em&gt; 생체내에</em&gt; RNAi)이 문서의 프로토콜에 의해 내용으로 조작.

약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는<em자포니카> Dugesia</em

자유 생활을 하는 플라나리아 편형동물은 놀라운 재생 능력 덕분에 실험적으로 오랫동안 사용되어 왔습니다1. ...에서 절단된 작은 파편들은

다음 실험의 전반적인 목표는 약리학적 및/또는 유전자 녹다운 방법을 사용하여 파리안 플랫웜(Parian flatworms)의 재생 분석을 수행하고 조절하는 것입니다. 첫 번째 단계는 기본적인 절단 및 재생 분석법을 익히는 것입니다. 다음으로는 약물을 사용하여 재생 극성을 바꾸어, 예를 들어 머리가 두 개인 개체를 만드는 방법을 보여줍니다.마지막으로, 먹이 공급을 통한 in vivo RNAi 수행 방법에 대해 설명합니다. 이는 특정 유전자의 기능 상실 효과를 조사하기 위함입니다. 결과에 따르면, 약물 quintal 처리는 재생 과정을 방해하여 머리가 두 개인 벌레를 생성하며, betaine과 isoform의 유전적 knockdown은 이와 매우 유사한 표현형을 나타냅니다.안녕하세요, 저는 marching 실험실의 대학원생인 John Chan이며, 이번 절차들을 시연하겠습니다. 개별 단계 자체는 어렵지 않으나, 이러한 방법들을 시각적으로 시연하는 것은 중요합니다. 이 기술들에 대한 전반적인 시연은 이 모델 시스템을 처음 접하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.분석 준비를 위해, 약 30마리의 parian 코호트에게 최소 5일 동안 먹이 공급을 중단하여 굶깁니다. 분석 당일 벌레의 길이는 8에서 10 mm 사이여야 합니다. 미리 수평을 맞춘 얼음 접시를 물로 헹구고, 핀셋을 사용하여 평평한 얼음 표면을 플라스틱 랩으로 덮습니다.플라스틱 랩 위에 거름종이를 한 장 놓습니다. 전이 피펫을 사용하여 거름종이에 스프링 워터를 몇 방울 떨어뜨려 적신 후, 거름종이 위에 20 pl 이하의 worm을 옮깁니다. 필요한 경우, 스프링 워터를 더 추가하여 피펫팅함으로써 worm의 위치를 다시 조정할 수 있습니다.벌레를 적절한 위치에 놓은 후, 메스를 사용하여 과잉 액체를 제거하고, 동물의 전방 정점과 인두 전단 사이의 약 중간 지점을 한 번 절단하여 머리 부분을 절단합니다. 다음으로, 동물의 꼬리 끝과 인두 후단 사이의 약 중간 지점을 한 번 절단하여 꼬리 영역을 절단합니다. 절단 후에는 70% ethanol을 적신 종이 타월을 사용하여 메스에 묻은 과잉 점액을 제거하고, 다시 절단하기 전에 메스에 남은 과잉 ethanol을 닦아냅니다.포셉으로 필터를 집어 샘물을 담은 페트리 접시에 옮깁니다. 상처 부위가 좁아지고 어둡게 변하며 상처 폐쇄가 관찰될 때까지 약 3분 동안 기다립니다. 필터 페이퍼에서 몸통 파편들을 재생 분석을 위해 준비된 배지가 담긴 페트리 접시로 씻어 옮긴 후, 24 °C로 설정된恒溫 인큐베이터로 옮깁니다.약 일주일 후 재생 표현형을 점수화합니다. 재생된 구조를 식별할 수 있게 되면, 약물을 DMSO에 용해시켜 200 millimolar quintal 또는 PZ Q 스톡을 조제하여 당일에 즉시 사용하십시오. 다음으로, buffered majic salts에 PZ Q 스톡 22.5 microliters를 첨가하고 약 일분 동안 볼텍싱하여 약물이 포함된 용액 50 milliliters를 만듭니다.분산 상태를 유지하기 위해 벌레를 스프링 워터로 적신 여과지에 놓고, trunk fragmentation regeneration assay에서 설명한 대로 머리와 꼬리 부위를 모두 절단합니다. 절단 및 상처 폐쇄가 완료되면, 몸통 단편들을 스프링 워터가 담긴 페트리 접시로 옮깁니다. 배지를 90 µM PZ Q 용액으로 교체하고 페트리 접시를 24 °C 인큐베이터로 옮깁니다. 24~48시간 후, PZ Q가 포함된 배지를 스프링 워터로 교체하여 벌레를 여러 번 세척한 뒤 다시 인큐베이터로 옮기고, 1주일 후 분석 전 벌레의 양극성 또는 이두성 표현형을 점수화합니다.닭 간 균질액을 준비합니다. 식용 원료에서 지방이 섞인 노란색 부위를 제거한 후, 남은 간을 퓨레 형태로 만듭니다. 퓨레를 고운 체(mesh strainer)로 걸러낸 후, 저장용 수성 현탁액을 준비합니다. 다음으로, 소 적혈구(RBC)를 1 mL씩 분주하여 -20 °C에서 보관하며 준비합니다.5일 동안 굶긴 벌레를 사용하여 세 개의 코호트로 그룹화합니다. 관심 유전자의 양성 대조군은 RNAi 표현형이 알려진 유전자로 하며, 음성 대조군은 RNAi 표현형이 없는 유전자로 합니다.각 코호트당 길이가 8~10mm인 웜을 약 250마리씩 사용합니다. 관심 유전자를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA를 발현하는 E. coli 스톡을 각 코호트별로 해동하고, 닭 간 균질액 튜브와 RBC 튜브를 함께 준비합니다. 13,000 Gs에서 1분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 700 µL의 2X YT 배지에 재현탁합니다.다시 원심분리하고, 상층액을 버린 후 펠렛을 얼음에 둡니다. P 200 피펫 팁의 끝부분을 잘라 구멍이 큰 팁을 만들어, 150 µL의 닭 간 균질액과 50 µL의 RBC를 더해 박테리아 펠렛을 완전히 재현탁하여 RNAi 먹이 혼합물을 만듭니다. 먹이 공급을 위해 짧게 원심분리하여 기포를 제거합니다.벌레가 들어 있는 플라스틱 통에서 물의 대부분을 제거하여 깊이가 약 1인치 정도만 남깁니다. 통을 회전시켜 벌레들을 용기 중앙으로 모읍니다. 그런 다음 RNAI feeding mix를 원형으로 피펫팅하여 벌레들을 가둡니다.약 1시간 동안의 피딩 후, 전이 피펫을 사용하여 다른 개체들에게 영향을 주지 않으면서 탈출한 개체들을 RNAi 피딩 믹스로 조심스럽게 유도하십시오. 피딩이 잘 된 파리안(parian)을 식별하고, 충분히 섭취하지 않은 것으로 보이는 벌레들은 제거하십시오. 잘 먹은 벌레들은 섭취한 RBC로 인해 진한 붉은색을 띱니다.먹이 섭취를 방지하기 위해 교란을 최소화하면서 급이 용액을 깨끗한 천연수로 조심스럽게 교체하십시오. 이를 위해 전송 파이프를 사용하여 벌레들을 수조의 한쪽으로 천천히 몰아넣으십시오. 오염된 물을 따라내고, 공기 중에 오래 노출되지 않도록 신속하게 잠기게 하면서 수조의 반대편 벽면을 따라 깨끗한 물을 조심스럽게 채우십시오.또한 이는 느슨하게 먹이 섭취 결과로 이어집니다. 용기 뚜껑을 밀봉하고 벌레들을 24 degrees Celsius 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오. RNAi 표현형을 최종적으로 스크리닝하기 위해, 재생 주기와 교대로 이 RNAi 먹이 공급 프로토콜을 여러 사이클 동안 반복하십시오.많은 유전자에 효율적인 표준 급이 및 재생 일정이 여기에 제시되어 있습니다. F는 급이 프로토콜을 나타내며 X는 재생 분석을 나타냅니다. 전체 프로토콜은 약 한 달이 소요되며, 최적의 프로토콜은 mRNA 안정성, 조직 국소화, 단백질, P dur 또는 재생 후 여러 번의 급이 주기를 방해하는 표현형의 발현과 같은 요인에 따라 달라지므로, 괄호로 표시된 F와 같이 급이 횟수를 줄이거나 더 늘려 다양한 유전자에 맞게 수정할 수 있습니다.다음은 몸통 재생 분석의 전형적인 결과입니다. 왼쪽에는 절단 부위를 나타낸 도식 위에 파리안(parian)의 모습이 나와 있습니다. 오른쪽은 7일에 걸쳐 진행되는 몸통 조각의 재생 과정이며, 3일째에 안점이 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.여기서는 PZ Q에 의한 몸통 단편 재생의 약리학적 억제를 다룹니다. DJ 61 유전자에 대한 RNAi 처리를 통해 머리가 두 개 달린 벌레가 생성되었습니다. FX FX 먹이 공급 프로토콜은 ilis 표현형을 유발하며, FFFX 먹이 공급 프로토콜 이후에는 빛 회피 반응의 소실이 관찰됩니다. 빨간색으로 염색된 DJ PC two RNAi 벌레는 대조군과 비교하여 이동성이 없는 상태입니다. 녹색으로 염색된 벌레는 DJ beta catine의 RNAi 넉다운이 이루어진 개체입니다.FXFX 공급 프로토콜을 사용하면 후방 상처 부위로부터 머리가 재생됩니다. 이러한 절차를 통해 연구자는 넉다운 방법이나 선택적 약물을 사용하여 연구 관심 유전자를 표적으로 삼음으로써, 파리안(parian)의 생물학 및 조직 재생에서 해당 유전자의 역할을 탐구할 수 있게 됩니다.

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약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는 Dugesia

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