Name: 스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 학습하세요 글루코코르티코이드 수용체와 Hsp90 단백질 복합체의 생화학적 재구성 방법을 통해 스테로이드 리간드 결합 활성을 재활성화하는 기술을. 이 방법은 단백질 상호작용 및 신호 전달 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강 부여 GM086822 호프, 심장 연구소 기초 과학 수상하고, MJ 머독 자선 신탁 대학 과학 연구 프로그램의 국립 연구소에 의해 투자되었다. 전기 영동의 시약을 선택하고 이미지 분석 소프트웨어는 넉넉한 바이오 방사선에 의해 제공되었다.

<ol><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%3A+implications+for+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li>
<li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li>
<li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+steroid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li>
<li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry%2C+abundance%2C+and+functional+significance+of+the+hsp90%2Fhsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li>
<li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li>
<li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li>
<li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li>
<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li>
<li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%26bull%3BHsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li>
<li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+%28Chk1%29+and+the+progesterone+receptor+%28PR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li>
<li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li>
</ol>

전기 영동의 시약을 선택하고 이미지 분석 소프트웨어는 바이오 방사선에 의해 제공되었다.

위에서 설명한 분석은 hsp90/hsp70-based 보호자 기계의 보호자 역할 행동뿐만 아니라, GR 스테로이드 바인딩에 영향을 미치는 조건의 수많은 테스트를 적용할 수 있습니다. 그것은 이전에 보고된 방법 4,8,9,17의 수정이며 전기 영동 기술의 최근 발전을 활용하고 광범위한 연구 커뮤니티에 액세스할 수 있도록 설계되었습니다. 관심의 추가 cofactors이나 단백질은 GR에 추가할 수 있습니다 스테로이드 구속력 heterocomplex 단백질 단백질 상호 작용, 그리고 공동 요소 요구 사항에 대한 효과를 관찰하기 위해 프로토콜의 4 단계에서 설명한 • hsp90 heterocomplex의 reconstitution 혼합물,. 예를 들어, hsp90 기능에 국소 빈혈 reperfusion -의 영향은 반응 산소 종의 증가 농도의 추가와 모델 수 있습니다. 특정 기능 (예 : acetylated hsp90) 또는 잠재 hsp90 억제제 (예 : 소설 geldanamycin의 analogs)와 정화 단백...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Sf9 곤충 세포 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> 재조합 마우스 GR의 baculovirus 발현을위한 </td></tr><tr><td> L929 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL - 2173 </td><td> 내생 마우스 GR cytosol 준비 (baculovirus 발현에 대안)에 대한 </td></tr><tr><td> FiGR 하이 브리 도마 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL - 2173 </td><td> (정화 BuGR2 항체로 대체) 안티 - GR 단클론 항체를 포함하는 복수를 준비 </td></tr><tr><td> 완료 - 미니 테아제 억제제, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 </td><td> 호슈 응용 과학 </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 A - 세파 로스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 reticulocyte lysate </td><td> 그린 헥타르 (오레곤, WI) </td><td></td><td> 내생 hsp90/hsp70 보호자 기계 풍부한 소스 </td></tr><tr><td> 크레아틴 phosphokinase </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C3755 </td><td> ATP - 재생 시스템 </td></tr><tr><td> phosphocreatine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P7936 </td><td> ATP - 재생 시스템 </td></tr><tr><td> 안티 GR 마우스 단클론 항체 (BuGR2) </td><td> 피어스 / 써모 과학 </td><td> MA1 - 510 </td><td> GR immunoadsorption 사용과 서양 blotting에서와 같이 기본 항체 </td></tr><tr><td> 안티 hsp90 마우스 단클론 항체 (AC88) </td><td> 엔조 생명 과학 </td><td> ADI - SPA - 830 </td><td> 서쪽은 blotting의 기본 항체로 사용 </td></tr><tr><td> 안티 hsp70 마우스 단클론 항체 (N27F3 - 4) </td><td> 엔조 생명 과학 </td><td> ADI - SPA - 820 </td><td> 서쪽은 blotting의 기본 항체로 사용 </td></tr><tr><td> 마우스 혈청에서 IgG </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 038K7690 </td><td> immunoadsorption의 부정적인 제어를위한 nonimmune 항체로 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 IgG - 퍼옥시데이즈의 활용 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A4416 </td><td> 서쪽은 blotting에서 보조 항체로 사용 </td></tr><tr><td> Experion microfluidic 전기 영동 시스템 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 7,007,001 </td><td> 종래의 SDS - PAGE로 대체 </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] dexamethasone </td><td> PerkinElmer </td><td> NET1192001MC </td><td> 안전주의 사항을 따르십시오 </td></tr></tbody></table>

스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 reconstitution • hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90은 세포 자전거에 관련된 전사 인자 (예 : 핵 수용체, p53의)와 단백질 kinases (예 : SRC, RAF, Akt 키나제)를 포함한 150 개 이상의 진핵세포 신호 단백질을 조절하는 것으로 판명되었습니다 순수하고 매우 풍부한 분자 보호자 역할 단백질입니다 tumorigenesis, apoptosis, 여러 진핵세포 신호 경로 1,2. hsp90 이러한 다양한 &#39;고객&#39;단백질의 스테로이드 수용체의 조립 • hsp90 단지는 (그림 1) 정의 가장됩니다. 우리는 여기서 적응 글루코 코르티 코 이드 수용체 (GR) immunoprecipitation 분석과 쉽게 진핵세포 hsp90 기능 활동, 바인딩 hsp90 - 중재 스테로이드 수용체 리간드 및 분자 보호자 역할 cofactor 요구 사항을 탐사하는 데 사용할 수 있습니다 체외 GR에 • hsp90 reconstitution 방법을 제시한다. 예를 들어,이 분석은 hsp90 cofactor 요구 사항 및 reconstitution 과정 외인성 화합물을 추가의 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 수용체는 스테로이드 3 액세스할 수 있습니다 분열 오픈 리간드 바인딩을 hsp90에 바인딩해야하기 때문에 GR은 hsp90를 공부에 특히 유용 시스템되었습니다. 내생, unliganded GR은 noncovalently hsp90에 바인딩 포유 동물 세포의 세포질에 존재합니다. 이름으로 내생 GR • hsp90 heterocomplex에서 발견, 갈라진 GR의 리간드 바인딩은 개방적이고 구속력 스테로이드 가능합니다. hsp90 GR에서 dissociates 또는 그 기능이 저해되면 수용체는 스테로이드 구속 수 있으며, 스테로이드 구속력이 활동을하기 전에 GR • hsp90 heterocomplex의 reconstitution을 필요로 4를 복원하는 경우. GR은 단클론 항체를 사용하여 셀 cytosol에서 immunoprecipitated, 그리고 서양 얼룩에 의해 assayed 수있는 등 hsp90와 같은 단백질은 GR에 complexed 수 있습니다. immunoprecipitated GR의 스테로이드 결합 활동은 [3 H] 스테로이드와 immunopellet을 잠복기에 의해 결정하실 수 있습니다. 이전 실험 분열 GR의 리간드 바인딩의 hsp90 - 중재 열기를 보이고있다하면 진핵 세포 생존을위한 hsp70, 두 번째 분자 보호자도 중요합니다. hsp90 및 hsp70의 생화 학적 활동이 공동 보호자 역할 단백질의 홉, hsp40, 그리고 p23 5 촉매 있습니다. hsp90, hsp70, 타, 그리고 hsp40를 포함하는 multiprotein의 보호자 기계는 진핵 세포 세포질에 endogenously 존재하고 있으며, reticulocyte lysate는 보호자 풍부한 단백질 소스 여섯를 제공합니다. 표시 방법에서 GR은​​ 셀 cytosol에서 immunoadsorbed하고 온화한 소금 조건을 사용하여 내생 hsp90/hsp70 보호자 기계 찟겼어. 소금 막았죠 GR은 다음 GR의 reconstitution 결과 reticulocyte lysate, ATP, 그리고 K +와 incubated입니다 스테로이드 바인딩 활동 7 • hsp90 heterocomplex 및 재활 성화. 이 방법은 hsp90 - 중재 스테로이드 결합 8-11 그들의 기능 중요성을 결정하기 위해 다양한 보호자 역할 cofactors, 소설의 단백질, 그리고 실험 hsp90 또는 GR 억제제의 효과를 테스트하기 위해 이용하실 수 있습니다.

<em&gt; 체외에서</em• hsp90 단백질 단지 단백질과 세포 lysates을 정화의 기능 글루코 코르티 코 이드 수용체 (GR)를 준비&gt; 방법을 설명합니다. 방법은 소금 조직 및 단백질 복잡한 reconstitution 다음 재조합 GR의 immunoadsorption을 활용합니다. 잠재적인 방법을 응용 프로그램이 같은 cofactors와 버퍼 조건의 중요성이 논의됩니다.

스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

Hsp90는 150가지 이상의 진핵생물 신호 전달 단백질을 조절하는 것으로 밝혀진, 필수적이며 매우 풍부한 분자 샤페론 단백질로, ...

이 절차의 전반적인 목적은 스테로이드 수용체 HSB 90 단백질 복합체를 생화학적으로 재구성하고 스테로이드 수용체 리간드 결합 활성을 재활성화하는 것이며, 이는 HSB 90 보조인자 요구 사항과 재구성 과정에 외성 화합물을 추가했을 때의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있습니다. 이는 먼저 기능성 당질코르티코이드 수용체가 포함된 세포 세포질을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포 세포질로부터 GR을 면역 흡착하고 내성적으로 제거합니다.HSP 90가 해리됩니다. 그 후 외인성 HSP 90과 다른 샤페론 단백질 및 보조 인자를 사용하여 GR HSP 90 헤테로 복합체를 재구성합니다. 마지막으로, 재구성된 단백질 복합체와 리간드 결합 활성을 분석하며, 특히 SDS page, 웨스턴 블로팅 및 방사성 리간드 결합 분석과 같은 방법이 GR HSP 90 헤테로 복합체 형성 및 스테로이드 결합 활성을 보여주는 데 사용됩니다.이 방법은 HSP 90의 기능적 활성을 촉진하는 데 필요한 보조 샤페론(cofactor chaperone)과 COS 샤페론이 무엇인지와 같이 HSP 90 분자 샤페론 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 단백질 접힘에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, HSP 90 의존성 리드 화합물 개발 및 HSP 90이 필요한 세포 내 신호 전달 경로 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 절차 시연은 제 실험실의 최근 졸업생인 Hannah Franklin과 Nathan for AWA 두 학생이 맡을 예정입니다. 기능적인 당질코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor) 또는 GR을 분리하려면, 재조합 GR 바쿠로바이러스에 감염되어 대수 성장기에 있는 마우스 섬유아세포 L 9 29 세포 또는 Sf9 세포를 배양하십시오. 세포 현탁액을 4 °C에서 5,000 Gs로 5분 동안 원심 분리하십시오.결과물로 얻은 펠렛의 부피는 약 1~5 mL가 되어야 합니다. 세포 펠렛을 15 mL의 Hank's balanced salt solution으로 3회 세척합니다. HEM 버퍼, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF) 및 다운스(downs)로 50회 갈아 만든 complete mini protease inhibitor 정제 3개를 포함하는 균질화 버퍼를 1.5배 부피로 준비합니다.균질기를 사용하여 세포를 파쇄하였으며, 단백질 분해를 방지하기 위해 모든 단계를 얼음 위에서 수행하였다. 균질액을 4°C에서 100,000 Gs로 30분 동안 초원심분리한다. 세포질이 포함된 상층액을 500 µL씩 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주하여 -20°C에서 보관한다.수용체 특이적 GR에 대해 생성된 단클론 IgG 항체를 포함하는 혼합물을 준비하려면, 해동된 GR 함유 세포질 100 µL, TEGM 버퍼 200 µL, 20% 단백질 A-sepharose 또는 PAS 슬러리 100 µL, 그리고 bugger 2와 같은 anti-G 단클론 IgG 항체 5 µg을 혼합하십시오. PAS 비드의 크기가 상대적으로 크기 때문에.끝을 자른 P 200 피펫 팁을 사용하여 20% 슬러리에서 PAS를 샘플 튜브로 옮깁니다. 샘플을 수직 회전 휠에 놓고 일정하게 회전시키며 최소 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 샘플을 냉장 원심분리기에서 1분 동안 원심분리하여 항체 PAS 펠릿에서 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.10,000 Gs에서 1 mL의 TEGM 버퍼를 첨가하고 볼텍싱한 후 원심분리하여 펠릿을 두 번 세척합니다. 내인성 HSB 90을 GR 면역 펠릿에서 분리하기 위해 크림프 처리된 P 200 피펫 팁을 사용하여 마지막 세척액을 제거하고, 이전에 준비된 PAS 펠릿의 항체에 355 µL의 TEG 버퍼와 45 µL의 5 M 염화나트륨을 첨가합니다.샘플을 수직 회전 휠에 놓고 일정하게 회전시키며 1시간 30분 동안 배양합니다. 10,000 Gs에서 1분 동안 원심분리하여 면역 펠릿(immuno pellet)으로부터 결합되지 않은 단백질을 제거합니다. 펠릿을 1 mL의 TEG 완충액으로 한 번, 10 mM HEPES 완충액(pH 7.4) 1 mL로 한 번 세척합니다. 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며, 끝을 구부린 P 200 피펫 팁을 사용하여 세척액을 제거합니다.GR HSB 90 이종 복합체를 재구성하려면, 펠렛에 토끼 망상적혈구 용해물과 같은 분자 샤페론 공급원 50 µL와 ATP 생성 시스템 5 µL가 포함된 혼합물을 첨가합니다. 다음 단계는 펠렛과 재구성 용액이 충분히 혼합되도록 하는 데 매우 중요합니다. 샘플을 30 °C 워터배스에서 정확히 20분 동안 배양합니다.펠릿을 부드럽게 분산시키고 재구성 용액을 섞기 위해 1~2분마다 튜브를 톡톡 쳐줍니다. 1 mL의 TEGM 버퍼를 추가하고 볼텍싱한 후 10,000 Gs에서 1분 동안 원심분리합니다. 펠릿이 손상되지 않도록 주의하여 상층액을 제거합니다.재구성된 펠렛(pellet) 내의 단백질을 확인하기 위해 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. $\beta$-mercaptoethanol이 포함된 SDS page 샘플 버퍼 50 $\mu$L를 추가하여 전기영동용 샘플을 준비합니다. 샘플을 혼합한 후, 끓는 물 중탕 또는 100 °C의 전자 히팅 블록에서 5분 동안 배양합니다.시료를 10,000 Gs에서 1분 동안 원심분리합니다. 이 시료의 상층액을 SDS page 또는 마이크로플루이딕 전기영동 후 western blot에 사용하십시오. P 200 crimped tip을 사용하여 상층액을 로딩하면 펠릿이 실수로 흡입되는 것을 방지할 수 있습니다.다음 단계는 GR HSP 90 단백질 복합체의 스테로이드 결합 활성을 분석하는 것입니다. 삼중수소 표지 스테로이드를 사용하여, 재구성된 면역 침전물에 47.5 µL의 HEM 완충액과 2.5 µL의 2 µM 삼중수소 표지 덱사메타손을 추가하며 시작합니다.마이크로 원심분리 튜브 벽면에 샘플이 묻어 손실되는 양을 최소화하도록 주의하며 펠렛을 부드럽게 혼합합니다. 샘플을 얼음 위에서 밤새 안정된 상태로 배양합니다. TEGM 버퍼 1 mL를 첨가하고 부드럽게 혼합한 후, 10,000 g에서 1분 동안 원심분리합니다.주의하며 상층액을 제거하십시오. 상층액에는 결합되지 않은 tritium 표지 스테로이드가 포함되어 있습니다. TEGM 완충액으로 총 3회 세척을 완전히 반복하십시오. 마지막 세척 단계가 끝나면 모든 상층액을 제거하십시오.크림프 처리된 P 200 피펫 팁을 사용합니다. 세척된 면역 펠렛을 200 µL의 TEGM 완충액에 현탁하여 10 mL 신틸레이션 바이알로 옮깁니다.바이알에 4.8 milliliters의 신틸레이션 칵테일을 넣고 볼텍싱합니다. 마지막으로 액체 신틸레이션 분광법을 수행하며, 대표적인 SDS page 및 western blot 데이터가 여기의 kumasi 염색 겔에 나타나 있습니다. 내인성 GR HSB 90 헤테로 복합체는 anti GR 항체를 사용하여 세포질에서 면역 흡착되었으며, GR과 함께 공동 흡착된 개별 단백질들이 시각화되어 나타나 있습니다.재구성된 GR HSP 90 이질 복합체를 나타내는 Experian 미세유체 전기영동 데이터입니다. 면역 흡착제로서의 anti GR 항체를 비면역 항체로 대체했을 때, 과량의 항체를 사용하더라도 GR이나 분자 샤페론이 면역 침전되지 않음으로써 GR 면역 흡착의 특이성이 확인되었습니다.마찬가지로, 염 제거(salt stripped)된 GR에서 HSP 90 및 기타 샤페론 단백질의 해리를 염 제거 및 재구성된 면역 침전물(immuno pellets)의 웨스턴 블롯을 통해 확인할 수 있습니다. 면역 흡착 항체의 중쇄는 쿠마시 염색과 웨스턴 블롯 모두에서 검출 가능하며, 이를 통해 각 레인에서 동일한 크기의 면역 침전물이 시각화되었음을 확인할 수 있습니다. 망상적혈구 용해물 또는 정제 단백질을 사용한 면역 흡착 GR의 대표적인 스테로이드 결합 활성 데이터가 여기에 제시되어 있습니다.재구성된 GR HSB 90 이종 복합체의 스테로이드 결합 활성은 일반적으로 내생 GR HSB 90 결합 활성 수준의 75~100%로 회복됩니다. 전기영동 데이터와 마찬가지로, 음성 대조군 및 비특이적 삼중수소 표지 스테로이드 결합의 측정값으로 anti GR 항체 대신 비면역 항체를 사용할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 HSP 90 번역 후 변형이 이종 복합체 재구성 및 스테로이드 결합에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 2D 겔 전기영동과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 여기에 기술된 것과 같은 재구성 분석을 통해 연구자들은 글루코코르티코이드 수용체를 모델 HSP 90 클라이언트 단백질로 사용하여 HSP 90 및 HSP 70 기반의 MultiPro 샤페론 기전과 그 단계적 조립의 기능적 중요성을 탐구할 수 있었습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 세포 용해물 내의 정제된 단백질로부터 기능성 당질코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor) HSP 90 단백질 복합체를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 수행 단계에는 GR 함유 세포 용해물 준비, 수용체 면역 흡착, 내인성 단백질의 염 처리 제거(salt stripping), 그리고 외인성 HSP 90, HSP 70 공동 인자 및 공동 샤페론을 이용한 이질 복합체의 재구성이 포함됩니다.

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