Name: 스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 학습하세요 글루코코르티코이드 수용체와 Hsp90 단백질 복합체의 생화학적 재구성 방법을 통해 스테로이드 리간드 결합 활성을 재활성화하는 기술을. 이 방법은 단백질 상호작용 및 신호 전달 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강 부여 GM086822 호프, 심장 연구소 기초 과학 수상하고, MJ 머독 자선 신탁 대학 과학 연구 프로그램의 국립 연구소에 의해 투자되었다. 전기 영동의 시약을 선택하고 이미지 분석 소프트웨어는 넉넉한 바이오 방사선에 의해 제공되었다.

<ol><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%3A+implications+for+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li>
<li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li>
<li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+steroid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li>
<li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry%2C+abundance%2C+and+functional+significance+of+the+hsp90%2Fhsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li>
<li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li>
<li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li>
<li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li>
<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li>
<li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%26bull%3BHsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li>
<li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+%28Chk1%29+and+the+progesterone+receptor+%28PR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li>
<li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li>
</ol>

전기 영동의 시약을 선택하고 이미지 분석 소프트웨어는 바이오 방사선에 의해 제공되었다.

위에서 설명한 분석은 hsp90/hsp70-based 보호자 기계의 보호자 역할 행동뿐만 아니라, GR 스테로이드 바인딩에 영향을 미치는 조건의 수많은 테스트를 적용할 수 있습니다. 그것은 이전에 보고된 방법 4,8,9,17의 수정이며 전기 영동 기술의 최근 발전을 활용하고 광범위한 연구 커뮤니티에 액세스할 수 있도록 설계되었습니다. 관심의 추가 cofactors이나 단백질은 GR에 추가할 수 있습니다 스테로이드 구속력 heterocomplex 단백질 단백질 상호 작용, 그리고 공동 요소 요구 사항에 대한 효과를 관찰하기 위해 프로토콜의 4 단계에서 설명한 • hsp90 heterocomplex의 reconstitution 혼합물,. 예를 들어, hsp90 기능에 국소 빈혈 reperfusion -의 영향은 반응 산소 종의 증가 농도의 추가와 모델 수 있습니다. 특정 기능 (예 : acetylated hsp90) 또는 잠재 hsp90 억제제 (예 : 소설 geldanamycin의 analogs)와 정화 단백...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Sf9 곤충 세포 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> 재조합 마우스 GR의 baculovirus 발현을위한 </td></tr><tr><td> L929 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL - 2173 </td><td> 내생 마우스 GR cytosol 준비 (baculovirus 발현에 대안)에 대한 </td></tr><tr><td> FiGR 하이 브리 도마 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL - 2173 </td><td> (정화 BuGR2 항체로 대체) 안티 - GR 단클론 항체를 포함하는 복수를 준비 </td></tr><tr><td> 완료 - 미니 테아제 억제제, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 </td><td> 호슈 응용 과학 </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 A - 세파 로스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 reticulocyte lysate </td><td> 그린 헥타르 (오레곤, WI) </td><td></td><td> 내생 hsp90/hsp70 보호자 기계 풍부한 소스 </td></tr><tr><td> 크레아틴 phosphokinase </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C3755 </td><td> ATP - 재생 시스템 </td></tr><tr><td> phosphocreatine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P7936 </td><td> ATP - 재생 시스템 </td></tr><tr><td> 안티 GR 마우스 단클론 항체 (BuGR2) </td><td> 피어스 / 써모 과학 </td><td> MA1 - 510 </td><td> GR immunoadsorption 사용과 서양 blotting에서와 같이 기본 항체 </td></tr><tr><td> 안티 hsp90 마우스 단클론 항체 (AC88) </td><td> 엔조 생명 과학 </td><td> ADI - SPA - 830 </td><td> 서쪽은 blotting의 기본 항체로 사용 </td></tr><tr><td> 안티 hsp70 마우스 단클론 항체 (N27F3 - 4) </td><td> 엔조 생명 과학 </td><td> ADI - SPA - 820 </td><td> 서쪽은 blotting의 기본 항체로 사용 </td></tr><tr><td> 마우스 혈청에서 IgG </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 038K7690 </td><td> immunoadsorption의 부정적인 제어를위한 nonimmune 항체로 사용 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 IgG - 퍼옥시데이즈의 활용 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A4416 </td><td> 서쪽은 blotting에서 보조 항체로 사용 </td></tr><tr><td> Experion microfluidic 전기 영동 시스템 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 7,007,001 </td><td> 종래의 SDS - PAGE로 대체 </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] dexamethasone </td><td> PerkinElmer </td><td> NET1192001MC </td><td> 안전주의 사항을 따르십시오 </td></tr></tbody></table>

스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 reconstitution • hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90은 세포 자전거에 관련된 전사 인자 (예 : 핵 수용체, p53의)와 단백질 kinases (예 : SRC, RAF, Akt 키나제)를 포함한 150 개 이상의 진핵세포 신호 단백질을 조절하는 것으로 판명되었습니다 순수하고 매우 풍부한 분자 보호자 역할 단백질입니다 tumorigenesis, apoptosis, 여러 진핵세포 신호 경로 1,2. hsp90 이러한 다양한 &#39;고객&#39;단백질의 스테로이드 수용체의 조립 • hsp90 단지는 (그림 1) 정의 가장됩니다. 우리는 여기서 적응 글루코 코르티 코 이드 수용체 (GR) immunoprecipitation 분석과 쉽게 진핵세포 hsp90 기능 활동, 바인딩 hsp90 - 중재 스테로이드 수용체 리간드 및 분자 보호자 역할 cofactor 요구 사항을 탐사하는 데 사용할 수 있습니다 체외 GR에 • hsp90 reconstitution 방법을 제시한다. 예를 들어,이 분석은 hsp90 cofactor 요구 사항 및 reconstitution 과정 외인성 화합물을 추가의 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 수용체는 스테로이드 3 액세스할 수 있습니다 분열 오픈 리간드 바인딩을 hsp90에 바인딩해야하기 때문에 GR은 hsp90를 공부에 특히 유용 시스템되었습니다. 내생, unliganded GR은 noncovalently hsp90에 바인딩 포유 동물 세포의 세포질에 존재합니다. 이름으로 내생 GR • hsp90 heterocomplex에서 발견, 갈라진 GR의 리간드 바인딩은 개방적이고 구속력 스테로이드 가능합니다. hsp90 GR에서 dissociates 또는 그 기능이 저해되면 수용체는 스테로이드 구속 수 있으며, 스테로이드 구속력이 활동을하기 전에 GR • hsp90 heterocomplex의 reconstitution을 필요로 4를 복원하는 경우. GR은 단클론 항체를 사용하여 셀 cytosol에서 immunoprecipitated, 그리고 서양 얼룩에 의해 assayed 수있는 등 hsp90와 같은 단백질은 GR에 complexed 수 있습니다. immunoprecipitated GR의 스테로이드 결합 활동은 [3 H] 스테로이드와 immunopellet을 잠복기에 의해 결정하실 수 있습니다. 이전 실험 분열 GR의 리간드 바인딩의 hsp90 - 중재 열기를 보이고있다하면 진핵 세포 생존을위한 hsp70, 두 번째 분자 보호자도 중요합니다. hsp90 및 hsp70의 생화 학적 활동이 공동 보호자 역할 단백질의 홉, hsp40, 그리고 p23 5 촉매 있습니다. hsp90, hsp70, 타, 그리고 hsp40를 포함하는 multiprotein의 보호자 기계는 진핵 세포 세포질에 endogenously 존재하고 있으며, reticulocyte lysate는 보호자 풍부한 단백질 소스 여섯를 제공합니다. 표시 방법에서 GR은​​ 셀 cytosol에서 immunoadsorbed하고 온화한 소금 조건을 사용하여 내생 hsp90/hsp70 보호자 기계 찟겼어. 소금 막았죠 GR은 다음 GR의 reconstitution 결과 reticulocyte lysate, ATP, 그리고 K +와 incubated입니다 스테로이드 바인딩 활동 7 • hsp90 heterocomplex 및 재활 성화. 이 방법은 hsp90 - 중재 스테로이드 결합 8-11 그들의 기능 중요성을 결정하기 위해 다양한 보호자 역할 cofactors, 소설의 단백질, 그리고 실험 hsp90 또는 GR 억제제의 효과를 테스트하기 위해 이용하실 수 있습니다.

<em&gt; 체외에서</em• hsp90 단백질 단지 단백질과 세포 lysates을 정화의 기능 글루코 코르티 코 이드 수용체 (GR)를 준비&gt; 방법을 설명합니다. 방법은 소금 조직 및 단백질 복잡한 reconstitution 다음 재조합 GR의 immunoadsorption을 활용합니다. 잠재적인 방법을 응용 프로그램이 같은 cofactors와 버퍼 조건의 중요성이 논의됩니다.

스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

Hsp90는 150가지 이상의 진핵생물 신호 전달 단백질을 조절하는 것으로 밝혀진, 필수적이며 매우 풍부한 분자 샤페론 단백질로, ...

이 절차의 전반적인 목적은 스테로이드 수용체 HSB 90 단백질 복합체를 생화학적으로 재구성하고 스테로이드 수용체 리간드 결합 활성을 재활성화하는 것이며, 이는 HSB 90 보조인자 요구 사항과 재구성 과정에 외성 화합물을 추가했을 때의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있습니다. 이는 먼저 기능성 당질코르티코이드 수용체가 포함된 세포 세포질을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포 세포질로부터 GR을 면역 흡착하고 내성적으로 제거합니다.HSP 90가 해리됩니다. 그 후 외인성 HSP 90과 다른 샤페론 단백질 및 보조 인자를 사용하여 GR HSP 90 헤테로 복합체를 재구성합니다. 마지막으로, 재구성된 단백질 복합체와 리간드 결합 활성을 분석하며, 특히 SDS page, 웨스턴 블로팅 및 방사성 리간드 결합 분석과 같은 방법이 GR HSP 90 헤테로 복합체 형성 및 스테로이드 결합 활성을 보여주는 데 사용됩니다.이 방법은 HSP 90의 기능적 활성을 촉진하는 데 필요한 보조 샤페론(cofactor chaperone)과 COS 샤페론이 무엇인지와 같이 HSP 90 분자 샤페론 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 단백질 접힘에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, HSP 90 의존성 리드 화합물 개발 및 HSP 90이 필요한 세포 내 신호 전달 경로 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 절차 시연은 제 실험실의 최근 졸업생인 Hannah Franklin과 Nathan for AWA 두 학생이 맡을 예정입니다. 기능적인 당질코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor) 또는 GR을 분리하려면, 재조합 GR 바쿠로바이러스에 감염되어 대수 성장기에 있는 마우스 섬유아세포 L 9 29 세포 또는 Sf9 세포를 배양하십시오. 세포 현탁액을 4 °C에서 5,000 Gs로 5분 동안 원심 분리하십시오.결과물로 얻은 펠렛의 부피는 약 1~5 mL가 되어야 합니다. 세포 펠렛을 15 mL의 Hank's balanced salt solution으로 3회 세척합니다. HEM 버퍼, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF) 및 다운스(downs)로 50회 갈아 만든 complete mini protease inhibitor 정제 3개를 포함하는 균질화 버퍼를 1.5배 부피로 준비합니다.균질기를 사용하여 세포를 파쇄하였으며, 단백질 분해를

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연구

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생물학

이 비디오에서는 CXCR4를 표적으로 하는 소분자가 존재할 때 CXC Chemokine Receptor 4(CXCR4)와 형광 표지된 천연 리간드 CXC Chemokine Ligand 12(CXCL12) 사이의 상호 작용을 검출하기 위한 유세포 분석 기반 경쟁 결합 분석에 대해 설명합니다. 더 낮은 소분자 농도를 가진 CXCR4 발현 세포를 배양하는 것은 소분자 농도에 있는 점차적인 증가에 점차적으로 감소하는 CXCR4-CXCL12 결합을 어느 정도 허용합니다.

수용체-리간드 상호작용을 방해하는 화합물을 식별하기 위한 경쟁력 있는 결합 분석

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

케토코나졸은 프레그난 X 수용체(PXR) 활성화에 결합하고 길항합니다. PXR 돌연변이의 효모 고처리량 스크리닝은 케토코나졸 결합을 위한 고유한 영역을 정의합니다. 이 효모 기반 유전 방법은 표면 결합 부위와 관련된 리간드와 새로운 핵 수용체 상호 작용을 발견합니다.

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

여기에서는 인간 백혈구 항원에 의해 제시되는 T-세포 수용체와 종양 항원 사이의 상호 작용의 본질이 T-세포 기능을 어떻게 지배하는지 결정하기 위해 실험실에서 일반적으로 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법에는 단백질 생산, X선 결정학, 생물 물리학 및 기능적 T 세포 실험이 포함됩니다.

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

우리는 4 hydroxy tamoxifen 종속 에스트로겐 수용 체 알파 ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동 포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 분석 하는 방법을 제시.

포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지

이 프로토콜은 GST 융합 TPR 모티프 공동 샤페론과 Hsp90 유래 펩타이드와 결합 된 수용자 구슬과 글루타티온 연결된 기증자 구슬을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 기술을 제시합니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 기술을 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

쿠매시 블리언트 블루 (CBB)의 polyacrylamide 젤의 G - 250로 단백질 얼룩에 대한 짧은 프로토콜은 CBB와 고전적인 얼룩 절차에서와 같이 유기 용제 또는 초산을 사용하지 않고도 설명되어 있습니다.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

학습하세요 글루코코르티코이드 수용체와 Hsp90 단백질 복합체의 생화학적 재구성 방법을 통해 스테로이드 리간드 결합 활성을 재활성화하는 기술을. 이 방법은 단백질 상호작용 및 신호 전달 연구에 활용됩니다.

스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

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