스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

이 절차의 전반적인 목적은 스테로이드 수용체 HSB 90 단백질 복합체를 생화학적으로 재구성하고 스테로이드 수용체 리간드 결합 활성을 재활성화하는 것이며, 이는 HSB 90 보조인자 요구 사항과 재구성 과정에 외성 화합물을 추가했을 때의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있습니다. 이는 먼저 기능성 당질코르티코이드 수용체가 포함된 세포 세포질을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포 세포질로부터 GR을 면역 흡착하고 내성적으로 제거합니다.

HSP 90가 해리됩니다. 그 후 외인성 HSP 90과 다른 샤페론 단백질 및 보조 인자를 사용하여 GR HSP 90 헤테로 복합체를 재구성합니다. 마지막으로, 재구성된 단백질 복합체와 리간드 결합 활성을 분석하며, 특히 SDS page, 웨스턴 블로팅 및 방사성 리간드 결합 분석과 같은 방법이 GR HSP 90 헤테로 복합체 형성 및 스테로이드 결합 활성을 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 HSP 90의 기능적 활성을 촉진하는 데 필요한 보조 샤페론(cofactor chaperone)과 COS 샤페론이 무엇인지와 같이 HSP 90 분자 샤페론 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 단백질 접힘에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, HSP 90 의존성 리드 화합물 개발 및 HSP 90이 필요한 세포 내 신호 전달 경로 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 절차 시연은 제 실험실의 최근 졸업생인 Hannah Franklin과 Nathan for AWA 두 학생이 맡을 예정입니다. 기능적인 당질코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor) 또는 GR을 분리하려면, 재조합 GR 바쿠로바이러스에 감염되어 대수 성장기에 있는 마우스 섬유아세포 L 9 29 세포 또는 Sf9 세포를 배양하십시오. 세포 현탁액을 4 °C에서 5,000 Gs로 5분 동안 원심 분리하십시오.

결과물로 얻은 펠렛의 부피는 약 1~5 mL가 되어야 합니다. 세포 펠렛을 15 mL의 Hank's balanced salt solution으로 3회 세척합니다. HEM 버퍼, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF) 및 다운스(downs)로 50회 갈아 만든 complete mini protease inhibitor 정제 3개를 포함하는 균질화 버퍼를 1.5배 부피로 준비합니다.

균질기를 사용하여 세포를 파쇄하였으며, 단백질 분해를 방지하기 위해 모든 단계를 얼음 위에서 수행하였다. 균질액을 4°C에서 100,000 Gs로 30분 동안 초원심분리한다. 세포질이 포함된 상층액을 500 µL씩 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주하여 -20°C에서 보관한다.

수용체 특이적 GR에 대해 생성된 단클론 IgG 항체를 포함하는 혼합물을 준비하려면, 해동된 GR 함유 세포질 100 µL, TEGM 버퍼 200 µL, 20% 단백질 A-sepharose 또는 PAS 슬러리 100 µL, 그리고 bugger 2와 같은 anti-G 단클론 IgG 항체 5 µg을 혼합하십시오. PAS 비드의 크기가 상대적으로 크기 때문에.

끝을 자른 P 200 피펫 팁을 사용하여 20% 슬러리에서 PAS를 샘플 튜브로 옮깁니다. 샘플을 수직 회전 휠에 놓고 일정하게 회전시키며 최소 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 샘플을 냉장 원심분리기에서 1분 동안 원심분리하여 항체 PAS 펠릿에서 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.

10,000 Gs에서 1 mL의 TEGM 버퍼를 첨가하고 볼텍싱한 후 원심분리하여 펠릿을 두 번 세척합니다. 내인성 HSB 90을 GR 면역 펠릿에서 분리하기 위해 크림프 처리된 P 200 피펫 팁을 사용하여 마지막 세척액을 제거하고, 이전에 준비된 PAS 펠릿의 항체에 355 µL의 TEG 버퍼와 45 µL의 5 M 염화나트륨을 첨가합니다.

샘플을 수직 회전 휠에 놓고 일정하게 회전시키며 1시간 30분 동안 배양합니다. 10,000 Gs에서 1분 동안 원심분리하여 면역 펠릿(immuno pellet)으로부터 결합되지 않은 단백질을 제거합니다. 펠릿을 1 mL의 TEG 완충액으로 한 번, 10 mM HEPES 완충액(pH 7.4) 1 mL로 한 번 세척합니다. 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며, 끝을 구부린 P 200 피펫 팁을 사용하여 세척액을 제거합니다.

GR HSB 90 이종 복합체를 재구성하려면, 펠렛에 토끼 망상적혈구 용해물과 같은 분자 샤페론 공급원 50 µL와 ATP 생성 시스템 5 µL가 포함된 혼합물을 첨가합니다. 다음 단계는 펠렛과 재구성 용액이 충분히 혼합되도록 하는 데 매우 중요합니다. 샘플을 30 °C 워터배스에서 정확히 20분 동안 배양합니다.

펠릿을 부드럽게 분산시키고 재구성 용액을 섞기 위해 1~2분마다 튜브를 톡톡 쳐줍니다. 1 mL의 TEGM 버퍼를 추가하고 볼텍싱한 후 10,000 Gs에서 1분 동안 원심분리합니다. 펠릿이 손상되지 않도록 주의하여 상층액을 제거합니다.

재구성된 펠렛(pellet) 내의 단백질을 확인하기 위해 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. $\beta$-mercaptoethanol이 포함된 SDS page 샘플 버퍼 50 $\mu$L를 추가하여 전기영동용 샘플을 준비합니다. 샘플을 혼합한 후, 끓는 물 중탕 또는 100 °C의 전자 히팅 블록에서 5분 동안 배양합니다.

시료를 10,000 Gs에서 1분 동안 원심분리합니다. 이 시료의 상층액을 SDS page 또는 마이크로플루이딕 전기영동 후 western blot에 사용하십시오. P 200 crimped tip을 사용하여 상층액을 로딩하면 펠릿이 실수로 흡입되는 것을 방지할 수 있습니다.

다음 단계는 GR HSP 90 단백질 복합체의 스테로이드 결합 활성을 분석하는 것입니다. 삼중수소 표지 스테로이드를 사용하여, 재구성된 면역 침전물에 47.5 µL의 HEM 완충액과 2.5 µL의 2 µM 삼중수소 표지 덱사메타손을 추가하며 시작합니다.

마이크로 원심분리 튜브 벽면에 샘플이 묻어 손실되는 양을 최소화하도록 주의하며 펠렛을 부드럽게 혼합합니다. 샘플을 얼음 위에서 밤새 안정된 상태로 배양합니다. TEGM 버퍼 1 mL를 첨가하고 부드럽게 혼합한 후, 10,000 g에서 1분 동안 원심분리합니다.

주의하며 상층액을 제거하십시오. 상층액에는 결합되지 않은 tritium 표지 스테로이드가 포함되어 있습니다. TEGM 완충액으로 총 3회 세척을 완전히 반복하십시오. 마지막 세척 단계가 끝나면 모든 상층액을 제거하십시오.

크림프 처리된 P 200 피펫 팁을 사용합니다. 세척된 면역 펠렛을 200 µL의 TEGM 완충액에 현탁하여 10 mL 신틸레이션 바이알로 옮깁니다.

바이알에 4.8 milliliters의 신틸레이션 칵테일을 넣고 볼텍싱합니다. 마지막으로 액체 신틸레이션 분광법을 수행하며, 대표적인 SDS page 및 western blot 데이터가 여기의 kumasi 염색 겔에 나타나 있습니다. 내인성 GR HSB 90 헤테로 복합체는 anti GR 항체를 사용하여 세포질에서 면역 흡착되었으며, GR과 함께 공동 흡착된 개별 단백질들이 시각화되어 나타나 있습니다.

재구성된 GR HSP 90 이질 복합체를 나타내는 Experian 미세유체 전기영동 데이터입니다. 면역 흡착제로서의 anti GR 항체를 비면역 항체로 대체했을 때, 과량의 항체를 사용하더라도 GR이나 분자 샤페론이 면역 침전되지 않음으로써 GR 면역 흡착의 특이성이 확인되었습니다.

마찬가지로, 염 제거(salt stripped)된 GR에서 HSP 90 및 기타 샤페론 단백질의 해리를 염 제거 및 재구성된 면역 침전물(immuno pellets)의 웨스턴 블롯을 통해 확인할 수 있습니다. 면역 흡착 항체의 중쇄는 쿠마시 염색과 웨스턴 블롯 모두에서 검출 가능하며, 이를 통해 각 레인에서 동일한 크기의 면역 침전물이 시각화되었음을 확인할 수 있습니다. 망상적혈구 용해물 또는 정제 단백질을 사용한 면역 흡착 GR의 대표적인 스테로이드 결합 활성 데이터가 여기에 제시되어 있습니다.

재구성된 GR HSB 90 이종 복합체의 스테로이드 결합 활성은 일반적으로 내생 GR HSB 90 결합 활성 수준의 75~100%로 회복됩니다. 전기영동 데이터와 마찬가지로, 음성 대조군 및 비특이적 삼중수소 표지 스테로이드 결합의 측정값으로 anti GR 항체 대신 비면역 항체를 사용할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 HSP 90 번역 후 변형이 이종 복합체 재구성 및 스테로이드 결합에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 2D 겔 전기영동과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 여기에 기술된 것과 같은 재구성 분석을 통해 연구자들은 글루코코르티코이드 수용체를 모델 HSP 90 클라이언트 단백질로 사용하여 HSP 90 및 HSP 70 기반의 MultiPro 샤페론 기전과 그 단계적 조립의 기능적 중요성을 탐구할 수 있었습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 세포 용해물 내의 정제된 단백질로부터 기능성 당질코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor) HSP 90 단백질 복합체를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 수행 단계에는 GR 함유 세포 용해물 준비, 수용체 면역 흡착, 내인성 단백질의 염 처리 제거(salt stripping), 그리고 외인성 HSP 90, HSP 70 공동 인자 및 공동 샤페론을 이용한 이질 복합체의 재구성이 포함됩니다.