단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정

본 절차의 전반적인 목표는 BioRad DUO flow 중압 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 재조합 단백질 정제를 위한 최적의 HI 액체 크로마토그래피 컬럼을 자동 스카우팅 방법으로 선택하는 것입니다. 이를 위해 먼저 필요한 버퍼와 목적 재조합 단백질이 포함된 박테리아 용해물을 준비합니다. 그다음, duo flow 크로마토그래피 시스템을 물리적으로 설치하고 배관을 연결하여 스카우팅 프로토콜을 위한 준비를 마칩니다.

그런 다음 샘플을 로딩하고, 프로그래밍된 HI 컬럼 스카우팅 방법을 실행하여 분획 샘플 EIT를 수집합니다. 마지막으로 EIT를 분석하고, 관찰된 분리 특성을 기반으로 최적의 HI 컬럼과 충진제를 결정합니다. 결과적으로 DUO flow 자동화 HI 컬럼 스카우팅 기능을 이용한 중압 액체 크로마토그래피를 통해, 연구자가 관심 있는 단백질의 스케일업 정제에 적합한 HI 컬럼 충진제를 확인할 수 있습니다.

수동 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 수행하는 기존 방법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은, 프로세스를 자동화함으로써 변동성을 줄이고 재현성이 매우 높은 결과를 보장한다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 현대 액체 크로마토그래피 시스템의 물리적 복잡성으로 인해 어려움을 겪을 수 있으나, 이는 충분히 숙달될 수 있습니다.

충분한 연습을 거친 후, 제 실험실의 학생인 Orange Stone과 Shelly Anderson이 해당 절차를 시연할 것입니다. 먼저 200 mM sodium phosphate(버퍼 A1), 200 mM sodium hydrogen phosphate(버퍼 A2), 4.8 M ammonium sulfate(버퍼 B2) 버퍼를 각각 500 mL씩 준비하십시오. 탈이온수는 버퍼 B1으로 사용됩니다. 최적의 크로마토그래피 작동 조건을 보장하기 위해 버퍼의 가스를 제거하십시오. 시스템 Maximizer가 버퍼 A1과 A2를 혼합하여 저염 인산염 용출 버퍼를 생성하고, 버퍼 B1과 B2를 혼합하여 고염 ammonium sulfate 버퍼를 생성하게 됩니다.

시작 버퍼. 정제할 단백질을 포함하는 세포 용해물 10 milliliters와 버퍼 B two 10 milliliters를 혼합하여 로딩할 샘플 20 milliliters를 준비합니다. 세포 용해물 샘플 용액의 최종 황산암모늄 농도는 약 2.4 molar가 되어야 하며, 이는 시작 버퍼와 거의 동일한 수준입니다.

용액 내의 입자성 물질을 제거하기 위해 저단백 결합 0.45 micrometer 시린지 필터로 용해물 버퍼 혼합물을 여과합니다. 시스템에 로딩하기 전까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 크로마토그래피 시스템의 물리적 설정 및 배관 연결은 이 절차에서 가장 복잡한 부분 중 하나입니다.

여기에 표시된 다이어그램에 따라 듀오 플로우 크로마토그래피 시스템을 설정하십시오. 전체 프로토콜에 충분한 양의 버퍼가 준비되어 있는지, 그리고 튜빙이 계속해서 잠겨 있을 수 있는지 확인하십시오. 여기에 예시된 대로 샘플 로딩 밸브와 다이내믹 샘플 루프를 연결하고, 샘플 루프를 3번 위치의 샘플 밸브 입구에 연결하십시오.

외경 1/16인치 피크 튜빙(peak tubing)을 동일한 크기로 8쌍 준비합니다. 그런 다음, 두 개의 컬럼 선택 밸브의 1번부터 8번 위치에 해당 쌍들을 연결합니다. UV 검출기 램프를 켜고 모든 검출기가 보정되었는지 확인한 후, 그림과 같이 분획 수집기의 스트림 분할 밸브와 분할 컨트롤러를 부착하십시오.

포지션 2 분획 수집기 분할 밸브와 분할 컨트롤러는 크로마토그래피 워크스테이션과 별도로 오프라인으로 작동합니다. 분할 백분율을 10으로 설정하십시오. 포지션 2 분획 수집기의 표준 분획 수집기 드롭헤드를 마이크로플레이트 드롭헤드로 교체하십시오.

샘플 루프를 헹구고 크로마토그래피 시스템을 플러싱합니다. 그 다음, 시스템을 통해 용리 버퍼를 분당 1 mL의 속도로 수동 유량을 흘려보내기 시작합니다. 1 mL high trap HI 컬럼을 컬럼 선택 밸브의 2번부터 8번 위치에 연결합니다.

2번 컬럼 선택 밸브를 연결하는 유니온을 제거합니다. 업스트림 컬럼 피팅을 듀오 플로우(duo flow)에 연결합니다. 모든 공기가 배출되고 버퍼 방울이 크게 맺힐 때까지 용리 버퍼를 피팅으로 흘려보냅니다.

다음으로 컬럼 입구에 연결된 스토퍼를 제거하고 컬럼 상단에 저염 버퍼를 크게 한 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 컬럼을 상류 피팅에 연결합니다. 출구는 하류 컬럼 피팅 및 선택 밸브 튜빙에 연결합니다.

배압 제한을 40 PS.I로 설정합니다. 1 mL/min의 유속으로 용출 버퍼 5 컬럼 부피를 사용하여 컬럼을 세척합니다. 1 mL/min의 유속으로 시작 버퍼 10 컬럼 부피를 사용하여 컬럼을 세척합니다.

pH, UV 트레이싱 및 배압이 안정되면 컬럼 선택 밸브를 수동으로 1번 위치로 전환하고 버퍼 흐름을 중단합니다. 시료를 로딩하려면 시료 유입 튜빙을 20 milliliter 시료에 담급니다. 그런 다음 시료 루프 로드 세척 밸브를 1번 위치로, 시료 로딩 밸브를 퍼지(purge) 위치로 전환합니다.

샘플 루프 로딩 펌프를 작동시켜 샘플이 샘플 로딩 밸브에 도달한 직후까지 1 mL/min의 유속으로 펌프 튜빙 내로 샘플을 흡입합니다. 샘플 로딩 밸브를 purge에서 load로 전환합니다. 생물학 소프트웨어의 설정 창에서 10 mL의 샘플이 다이내믹 샘플 루프로 흡입될 때까지 1 mL/min의 유속으로 샘플 루프 로딩 펌프를 다시 작동시킵니다.

이 표에서 별표로 표시된 시스템 장치들을 선택하십시오. 다음으로, 분석 프로그램을 위해 6개의 HIC 컬럼을 선택하십시오. 선형 하강 염 농도 구배와 6개 컬럼 스카우팅 방법을 통해 시작 버퍼의 유량을 분당 1 mL로 수동으로 시작합니다.

분할기 컨트롤러의 시작 버튼을 눌러 90%에서 10%로 이어지는 EIT 스트림 분할을 시작하십시오. 프로그램 메서드 실행을 시작한 직후, 오프라인 96웰 플레이트 분획 수집기의 화면 제어 패널에서 시작 버튼을 누르십시오. 실시간 디스플레이를 관찰하여 예상 실행 파라미터를 확인하십시오. GFP 특이적 397 nanometer 흡광도 추적 곡선을 일반 단백질 280 nanometer 흡광도 추적 곡선과 비교하여, 스카우팅 중인 서로 다른 HI 배지를 이용한 상대적 분리 및 정제도를 추정하십시오. 96웰 플레이트 분획물에서 5 to 50 µL의 분취액을 새 플레이트로 옮긴 후, ELISA 또는 Western blot으로 특정 단백질 함량을 측정하고, SDS page 또는 Experian 미세유체 전기영동 시스템을 사용하여 총 단백질 함량을 분석할 수 있습니다. 스카우팅 실행의 대표적인 Hick salt 구배 전도도와 컬럼 압력이 여기에 표시되어 있습니다.

고염 농도 버퍼 라인에서 유입된 버퍼의 백분율로 측정된 염 농도의 변화는 HI 방법론의 전형적인 특징입니다. 염 농도가 감소함에 따라 컬럼에 결합된 단백질들이 용출되며, 관찰되는 전도도에 대응하는 염 농도는 quad tech 및 UV 검출기 직후의 라인에서 측정됩니다. 염 구배(salt gradient)와 전도도 추적 곡선 사이의 오프셋은 버퍼가 버퍼 입구에서 시스템을 거쳐 전도도 모니터까지 이동하는 데 소요되는 시간을 나타냅니다.

시료 분석이 진행되는 동안 시스템 압력과 pH는 비교적 일정하게 유지됩니다. 이 그림은 총 단백질의 인라인 검출을 통한 연속적인 HI 컬럼 스카우팅 런의 크로마토그램을 보여줍니다. NGFP는 각각 280 nanometers와 397 nanometers에서의 빛 흡광도를 측정하여 수행합니다.

각 스카우팅 런(scouting run)에 대해 GFP의 상대적 풍부도와 분리 정도를 추정하는 것이 가능합니다. 이 그림의 두 라인을 비교하면, fennel FF 스카우팅 런의 분획(fraction) 10, 12, 14, 16, 18에 해당하는 배양 시험관을 주변광 또는 형광실내등과 자외선 램프 아래에서 각각 정면과 위에서 내려다본 방향으로 시각화하여 특성적인 GFP 방출 스펙트럼을 관찰하였으며, 분획 14에서 GFP가 명확하게 검출되었습니다. 두 UV 이미지 모두에서 왼쪽 UV 패널의 확산된 파란색은 UV 램프에서 방출된 빛입니다.

이러한 분석 후 데이터는 397 nanometers에서 용출액의 흡광도를 측정하여 GFP를 인라인으로 검출한 결과와 잘 일치하며, 이를 통해 fraction 14에 용출된 GFP의 주요 피크가 포함되어 있음을 확인할 수 있습니다. 이 절차 이후에, 정제 중인 단백질의 순도 및 기능적 활성과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 western blotting, ELISA, 원자 힘 현미경(atomic force microscopy) 및 생화학적 재구성 분석(biochemical reconstitution assays)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 방법의 여러 단계에서 이중 흐름 시스템을 수동으로 제어해야 한다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 버퍼 재충전 및 시료 로딩, 기포 확인, 필요에 따른 검출 램프의 온/오프 조작 등이 그 예입니다. 이 영상을 시청한 후에는 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 최적의 HI 컬럼 및 충전제를 자동 스카우팅하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

인라인 및 포스터 분석을 통한 평가 분석을 통해 연구자는 후속 스케일업 정제에 적합한 컬럼을 선택할 수 있으며, 이는 표적 단백질의 순도와 수율을 높이기 위해 다른 크로마토그래피 방법과 결합하여 사용할 수도 있습니다.