Name: 단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 배우세요 소수성 상호 작용 크로마토그래피 칼럼을 자동화된 스카우팅 방법으로 선정하여 재조합 단백질을 정제하는 기법입니다. 이 방법은 재현성과 효율성을 높여 생화학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강 교부금 GM086822과 국립 과학 재단의 주요 연구 계장 보조금 DBI-0960313 국립 연구소에 의해 재정 지원되었다. 저자는 Drs를 감사드립니다. 존 미야케 &amp; 도나 하디 (바이오 방사선)과 기술적 전문성을위한 제니퍼 Loertscher (시애틀 대학). 크로마 토그래피의 시약을 선택하고 추가 장비가 넉넉한 바이오 방사선에 의해 제공되었다.

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<li>Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+proteins+in+receptor+research%3A+an+emerging+tool+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).</li>
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</ol>

크로마 토그래피의 시약을 선택하고 추가 장비는 바이오 - 방사선에 의해 제공되었다.

액체 크로마 토그래피 기법 7 생화 학적, 면역 6을 수행하는데 필요한 고도로 정제된 단백질을 준비하고, 구조적 8 연구를 위해 귀중한를 입증했습니다. 혼성 집적회로 정화 방법은 가장 많이 선호하는 매체의 경험적 결정을 요구하고, 리간드 구조, 리간드 밀도, 그리고 매트릭스 비드 속성은 모든 색층 결과 2, 3에 영향을 보여줘왔다. 정찰 자동 열은 이후의 최적화 및 단백질 정제 4 혼성 집적회 매체 선택을위한 효율적인 접근 방법입니다. 제시 자동화된 컬럼 탐색 방법을 쉽게 다양한 혼성 집적회로 단백질 정제 전략에 적용할 수 있습니다. 소금 농도, 소금의 선택, 소금 그라데이션, 그리고 산도의 변경은 더 정화 조건을 향상시킬 수 있으며, 이러한 필수 매개 변수를 변화의 효과는 이전에 13,14을 검토하고있다. 부분적으로 정화 대상 prote를 포함하는 혼성 집적회로 eluate안에는 더 이상 이러한 이온 교환 크로마 토그래피 (IEX) 또는 겔 여과 / 크기 배제 크로마 토그래피 9,10과 같은 보완 색층 기법을 사용하여 투석을 할 수 있습니다. 워낙 독특한 조명 흡광도 및 방출 특성 때문에, GFP의 용출 프로파일은 인라인 및 사후 운영하는 방식을 사용하여 확인할 수 있습니다. 이를 위해,이 프로토콜은 더 이상 관련이없는 대상 단백질이 GFP와 &quot;태그가&quot;되는, 재조합 GFP-융합 단백질의 정제에 맞게 조정 할 수 있습니다. GFP-태그가 대상 단백질은 자외선 11 위에서 설명한 혼성 집적회로 정화 전략 등 다양한 색층 접근법을 사용하여 정제로 감지가 가능하다. GFP 정화는 또한 현대 단백질 과학 기술 12 교육을위한 생화학 실험실에서 교육학 주식이되었다. 기본적인 혼성 집적회로 단백질 정제는 크게 덜 강력한 크로마 토그래피 싸이를 사용하여 수행할 수 있지만줄기, 여기서 제시된 계측이 유리한 결과를 얻기에 투입하기 위해 뚜렷한 장점을 가지고 있습니다. 고도로 자동화된 시스템을 활용의 주목할만한 장점이 실행 대 실행 조건 재현성, 시간 절감 효과를 개선하고, 시스템 10에 소개되는 공기의 기회를 감소 등이 있습니다. 시스템 극대화에 의해 촉진되고 시스템 제어 버퍼 블렌딩은, 버퍼 준비 및 실험 재현성의 향상 일관성을 허용합니다. 모든 정찰을위한 동적 샘플 루프에 충분한 샘플 하중을 설계하고 실행하는 것은 더욱 각 컬럼에 추가되는 샘플의 균일을 보장하고 중단하거나 다시로드 매뉴얼없이 순차적인 실행을 허용합니다. 칼럼쪽으로 샘플 루프에서 제어 샘플 주입 수동 샘플 로딩과 함께 발생할 수있는 다양성을 낮춥니다. 열 선택 밸브의 쌍은 시스템을 replumb 필요없이 연속 샘플 실행, 다른 혼성 집적회로 컬럼을 사용하여 각각에 대해 허용합니다. mul 공연<html> 독특한 분광 프로필로 단백질을 시금 때 TI-파장 분석에 특히 유용합니다. GFP 외에도 cytochromes, flavoproteins 및 기타 헴 함유 단백질이 기술로부터 혜택을 누릴 수 있습니다. 전도율과 산도 모니터링 디바이스는 실시간 실험 조건의 확인을 위해 수 있습니다. 분할 분획 eluate 컬렉션은 향상된 분획 처리 가능하며 최소한의 샘플 볼륨 (예 : 엘리사, SDS-PAGE, 서부 얼룩 및 Experion microfluidic 전기 영동) 요구 이후의 운영 분석 방법에 대해 쉽게 전송이 가능합니다. 두 번째 분획 컬렉터 오프라인을 운영하는 것은 수동 동기화가 필요하지만, 그것은 분획 수집기 선택에 최대의 유연성을 허용합니다. 혼성 집적회로 정찰 칼럼 및 단백질 정제를 위해 이러한 강력한 크로마 토그래피 시스템을 활용하여 가장 중요한 단점은 초기 시간과 악기 수집 및 운영자 교육과 관련된 예산 지출을 포함합니다. T &quot;&gt; 여기를 제시 프로토콜 바이오 방사선 DuoFlow 크로마 토그래피 시스템을 활용,. 그러나, 이러한 GE 헬스케어에서 악타의 복고 등 다른 제조 업체,에서 똑같이 강력 계장도 활용 수 있으며, 이에 상응하는 결과를 생산하는 능력이있다하더라도 비교 크로마 토그래피 시스템 정화 절차 또는 악기 수집을 시작하기 전에 고려해야하는 고유의 특성 (예를 들면 메소드 프로그래밍, 컴포넌트 명명법, 사업자 환경, 그리고 확장성 제한)가.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">생물 학적 DuoFlow 탐험자 20 시스템</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7,602,257</a> </td><td> 시스템의 극대화, 믹서, F10 워크 스테이션, AVR7-3 밸브, QuadTec의 UV / 흐름 전지, BioFrac 분획 수집기, 생물 학적 소프트웨어 VIS 검출기 및 스타터 키트 포함 </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8 스트림의 선택 밸브</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7,600,408</a> </td><td> 생물 학적 DuoFlow 시스템에서 사용하기에 고압 밸브, 9 포트, 8 위치, 3,500 PSI (233 바) 한도, </td></tr><tr><td> 분배기 밸브 SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> 7,600,410 </td><td> 생물 학적 DuoFlow 시스템을 함께 사용하기위한 솔레노이드 밸브, 3 포트, 2 순위, 30 PSI (2 바) 한도, </td></tr><tr><td> 스트림 스플리터 밸브 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>tical = LSR &amp; parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; DynaLoop 25 키트 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7,500,451</a> </td><td> 샘플 루프 키트 슬라이딩 - 피스톤은 피스톤 루프를 슬라이딩 25 ML의 DynaLoop, DynaLoop 부품 키트 (# 750-0450)가 포함되어 있습니다 </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">BioFrac 분수 수집기</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7,410,002</a> </td><td> 두 분획 열<html> lectors 사용된 </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFrac microplate 드롭 헤드 어댑터</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7,410,088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFrac microtiter 플레이트 어댑터</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td>&amp; 국가 = 미국과 랭 = ko를 &amp; 제품 일련 = 741-0017 &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">자외선 광학 모듈</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7,500,202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">할로겐 램프</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> &lt;<html> 대상 = &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">이코노 그라데이션 펌프</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7,319,001</a> </td><td> 저압 단백질 정제를위한 기울기 펌프, 튜브 및 부속품 키트를 포함 </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion 시스템</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?에 cmd = BRCatgProductDetail &amp; 제품 일련 번호 = 224301 &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 7007001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Pro260 분석 키트</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">바이오 방사선</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7,007,102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap 혼성 집적회로 열 선택 키트 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28-4110-07 </td><td> 정찰을위한 혼성 집적회로 미디어 7 × 1 ML 미리 포장 열이 포함 </td></tr><tr><td> GE 헬스케어 - 투 - 바이오 - 방사선 칼럼 피팅 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 18111251 및 18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

정화 단백질 (예 : 젤 여과, 친화력, 그리고 이온 교환) 다른 색층 방법와는 달리, 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 (혼성 집적회로)는 일반적으로 가장 적합한 색층 매체를 선택하기 위해 실험적 결정 (심사 또는 &quot;정찰&quot;로 칭함)가 필요합니다 주어진 단백질 1 정화입니다. 여기에 제시된 방법은 단백질 정제에 사용되는 최적의 혼성 집적회로 미디어를 찾는다는 뜻에 대한 자동 접근 방식을 설명합니다. 혼성 집적회로가 소수성의 차이를 기반으로 원유 lysate에서 단백질 및 기타 biomolecules를 분리시킵니다. 친화성 크로마 토그래피 (AC)와 이온 교환 크로마 토그래피 (IEX)와 마찬가지로, 혼성 집적회는 색층 프로세스를 통해 진행됨에 따라 관심 단백질을 집중시킬 것입니다. 최고의 혼성 집적회로에 의해 정화에 적합 단백질은 소수성 표면 영역 및 2 M의 탄약을 초과하는 농도를 방해하기 위해 노출을 견딜 수있는 사람을 포함nium 황산 ((NH 4) 2 SO 4). 혼성 집적회로 종종 친화 태그가 부족한 단백질을위한 정제 방법으로 선택하고, 교류를위한 따라서 적합하고, IEX는 충분한 정화를 제공하는 데 실패하면된다. 단백질 표면의 소수성 moieties 일시적으로 불활성, 움직이기 힘드는 매트릭스를 결합 무극 성 리간드에 바인딩. 단백질과 리간드 사이의 상호 작용이 단백질 - 리간드 상호 작용을 강화하고 움직이기 힘드는 단백질 (즉, 열은 내부 구속) 2를 만들기 높은 이온 농도로, 크로마 토그래피 칼럼을 통해 흐르는 버퍼의 소금 농도에 크게 의존합니다. 소금 농도 감소로 단백질 리간드 상호 작용 없어져요, 단백질 다시 컬럼에서 모바일 및 elutes된다. 여러 혼성 집적회로 미디어가 미리 포장 컬럼에서 상업적으로 사용할 수있는 여러 소수성 리간드 (예 : octyl S-부틸, 부틸, 그리고 페닐) 각각 포함하는 하나 사양의 아가로 오스 비즈로 밀도를 변화에서 크로스는-연결된ific 직경 3. 정찰 자동 열은 혼성 집적회로 미디어가 앞으로 더 철저한 최적화 실험을 위해 고용 및 단백질 정제 4를 운영해야하는 결정하기위한 효율적인 접근을 허용합니다. 여기를 정화하는 특정 단백질은 재조합 녹색 형광 단백질 (GFP)입니다 있으나, 접근은 하나 이상의 소수성 표면 영역과 다른 단백질 정화에 맞게 조정될 수 있습니다. GFP가 자외선 5로 노출시의 안정성, 397 nm의에서 독특한 빛의 흡광 피크, 그리고 형광에 의한 유용한 모델 단백질로서의 역할을합니다. 야생 형 GFP를 포함하는 세균성 lysate는 높은 소금 버퍼에 준비된 바이오 방사선 DuoFlow 매체 압력 액체 크로마 토그래피 시스템에로드하고, 다른 혼성 집적회로 미디어를 포함하는 HiTrap 혼성 집적회로 컬럼에 adsorbed되었다. 단백질은 칼럼에서 eluted과 인라인 및 사후 운영하는 검출 방법에 의해 분석되었다. 버퍼 블렌딩, 동적 시료 루프 주입, 순차 열umn 선택, 다중 파장 분석 및 분할 분획 eluate 컬렉션은 실험적 접근 방식의 시스템과 재현성의 기능을 향상시켰습니다.

단백질 정제의 과정에서 사용될 적합한 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 (혼성 집적회로) 미디어를 식별하는 자동화된 방법을 설명하고있다. 방법은 자동화된 버퍼 블렌딩, 동적 시료 루프 주입, 순차 열 선택, 다중 파장 분석 및 분할 분획 eluate 컬렉션을 포함하여 중간 압력 액체 크로마 토그래피 시스템을 활용합니다.

단백질 정제를 위한 다른 크로마토그래피 방법(예: 겔 여과, 친화성 및 이온 교환)과 대조적으로, 소수성 상호작용...

본 실험 과정의 전반적인 목표는 BioRad DUO flow 중압 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여, 자동 스카우팅 방법을 통해 재조합 단백질 정제에 최적화된 HI 액체 크로마토그래피 컬럼을 선정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 필요한 완충액과 표적 재조합 단백질이 포함된 박테리아 용해물을 준비합니다. 그 다음, duo flow 크로마토그래피 시스템을 물리적으로 설치하고 배관을 연결하여 스카우팅 프로토콜을 수행할 수 있도록 준비합니다.그 후 샘플을 로딩하고 프로그램된 HI 컬럼 스카우팅 방법을 실행하여 분획 샘플 EIT를 수집합니다. 마지막으로, EIT를 분석하여 관찰된 분리 특성을 기반으로 최적의 HI 컬럼과 충전제를 식별합니다. 최종적으로 DUO flow 자동화 HI 컬럼 스카우팅 기능을 이용한 중압 액체 크로마토그래피를 통해, 연구자가 관심 있는 단백질의 스케일업 정제에 적합한 HI 컬럼 충전제 결과를 얻을 수 있습니다.수동 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 실행하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 공정을 자동화함으로써 변동성을 줄이고 결과의 재현성을 높일 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 현대 액체 크로마토그래피 시스템의 물리적 복잡성으로 인해 어려움을 겪을 수 있으나, 이는 충분히 숙달 가능합니다.충분한 연습 후, 본 절차의 시연은 제 실험실의 학생인 Orange Stone과 Shelly Anderson이 진행하겠습니다. 먼저 다음의 버퍼들을 500 mL씩 준비하십시오: 버퍼 A1용 200 mM sodium phosphate, 버퍼 A2용 200 mM sodium hydrogen phosphate, 그리고 버퍼 B2용 4.8 M ammonium sulfate입니다. 버퍼 B1으로는 탈이온수를 사용합니다. 최적의 크로마토그래피 작동 조건을 보장하기 위해 버퍼들을 탈기하십시오. 시스템 Maximizer가 버퍼 A1과 A2를 혼합하여 저염 phosphate 용출 버퍼를 생성하며, 버퍼 B1과 B2를 혼합하여 고염 ammonium sulfate 버퍼를 생성하게 됩니다.시작 완충액. 정제할 단백질이 포함된 세포 용해물 10 milliliters와 buffer B two 10 milliliters를 혼합하여 로딩할 샘플 20 milliliters를 준비합니다. 세포 용해물 샘플 용액의 최종 황산암모늄 농도는 약 2.4 molar가 되어야 하며, 이는 시작 완충액과 거의 동일한 수준입니다.용액에서 입자성 물질을 제거하기 위해 용해물 버퍼 혼합물을 단백질 결합력이 낮은 0.45 micrometer 시린지 필터로 여과하십시오. 샘플은 시스템에 로딩하기 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 크로마토그래피 시스템의 물리적 설치 및 배관 작업은 이 절차에서 가장 복잡한 단계 중 하나입니다.여기에 표시된 도표에 따라 듀오 흐름 크로마토그래피 시스템을 설정하십시오. 전체 프로토콜에 필요한 충분한 양의 완충액이 준비되었는지, 그리고 튜브가 계속 잠겨 있는지 확인하십시오. 여기에 설명된 대로 샘플 로딩 밸브와 동적 샘플 루프를 연결하고, 샘플 루프를 3번 위치의 샘플 밸브 입구에 연결하십시오.외경 1/16인치 피크 튜빙을 동일한 크기로 8쌍 준비합니다. 그다음, 이 튜빙 쌍들을 두 개의 컬럼 선택 밸브의 1번부터 8번 위치에 연결합니다. UV 검출기 램프를 켜고 모든 검출기가 보정되었음을 확인한 후, 그림에 표시된 대로 분획 수집기의 스트림 분할 밸브와 분할 컨트롤러를 장착합니다.포지션 2 분획 수집기 분배 밸브와 분배 컨트롤러는 크로마토그래피 워크스테이션과 별개로 작동됩니다. 분배 비율(percent split)을 10으로 설정하십시오. 포지션 2 분획 수집기의 표준 분획 수집기 드롭헤드를 마이크로플레이트 드롭헤드로 교체하십시오.샘플 루프를 헹구고 크로마토그래피 시스템을 플러싱합니다. 그다음, 시스템을 통해 전개 버퍼를 분당 1 mL의 속도로 수동 흐름을 시작합니다. 1 mL high trap HI 컬럼을 컬럼 선택 밸브의 2번부터 8번 위치에 연결합니다.2번 컬럼 선택 밸브를 연결하는 유니온을 제거합니다. 상류 컬럼 피팅을 듀오 플로우(duo flow)에 연결합니다. 모든 공기가 빠져나가고 버퍼 한 방울이 크게 맺힐 때까지 용리 버퍼를 피팅을 통해 흘려줍니다.다음으로, 컬럼 입구에 연결된 스토퍼를 제거하고 컬럼 상단에 저염 버퍼를 크게 한 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 컬럼을 상류 피팅에 연결하십시오. 출구를 하류 컬럼 피팅과 선택 밸브 튜빙에 연결합니다.배압 한계를 40 PS.I로 설정하십시오. 1 mL/min의 유속으로 용출 버퍼를 사용하여 컬럼 부피의 5배만큼 컬럼을 세척하십시오. 이어서 1 mL/min의 유속으로 시작 버퍼를 사용하여 컬럼 부피의 10배만큼 컬럼을 세척하십시오.pH, UV 트레이싱 및 배압(back pressure)이 안정화되면 컬럼 선택 밸브를 수동으로 1번 위치로 전환하고 버퍼 흐름을 중단합니다. 시료를 로딩하려면 시료 주입 튜브를 20 milliliter 시료에 담급니다. 그다음 시료 루프 로드 워시 밸브를 1번 위치로, 시료 로딩 밸브를 퍼지(purge) 위치로 전환합니다.샘플 루프 로딩 펌프를 작동시켜, 샘플이 샘플 로딩 밸브에 도달한 직후까지 1 mL/min의 유량으로 펌프 튜빙 내에 샘플을 흡입합니다. 샘플 로딩 밸브를 purge에서 load로 전환합니다. biologic 소프트웨어의 설정 창에서 샘플 루프 로딩 펌프를 1 mL/min의 유량으로 다시 작동시켜, 다이내믹 샘플 루프에 10 mL의 샘플이 흡입될 때까지 유지합니다.이 표에서 별표로 표시된 시스템 장치들을 선택하십시오. 다음으로, 분석 프로그램을 실행할 HIC 컬럼 6개를 선택하십시오. 선형 내림차순 염 농도 구배와 6개 컬럼 스카우팅 방법으로 시작 버퍼 유량을 분당 1mL로 수동 시작합니다.분할기 컨트롤러의 시작 버튼을 눌러 90%에서 10%로의 EIT 스트림 분할을 시작하십시오. 프로그램 메소드 런을 시작한 직후, 오프라인 96-웰 플레이트 분획 수집기의 온스크린 제어 패널에서 시작 버튼을 누르십시오. 실시간 디스플레이를 관찰하여 예상 실행 파라미터를 확인하십시오. GFP 특이적 397 nanometer 흡광도 트레이싱을 일반 단백질 280 nanometer 흡광도 트레이싱과 비교하여, 스카우팅 중인 서로 다른 HI 배지를 이용한 상대적 분리 및 정제 정도를 추정하십시오. 96-웰 플레이트 분획에서 5 to 50 µL의 aliquot을 새 플레이트로 옮긴 후, ELISA 또는 Western blot으로 특정 단백질 함량을 측정하거나 SDS-PAGE 또는 Experian 미세유체 전기영동 시스템을 사용하여 총 단백질 함량을 분석할 수 있습니다. 여기에는 스카우팅 런의 대표적인 Hick 염 농도 구배 전도도와 컬럼 압력이 표시되어 있습니다.고염 농도 버퍼 라인에서 유입된 버퍼의 백분율로 측정된 염 농도의 변화는 HI 방법론의 전형적인 특징입니다. 염 농도가 감소함에 따라 컬럼에 결합된 단백질들이 용리되며, 관찰된 전도도와 일치하는 염 농도는 quad tech 및 UV 검출기 직후의 라인에서 측정됩니다. 염 구배와 전도도 추적선 사이의 오프셋은 버퍼가 버퍼 입구에서 시스템을 거쳐 전도도 모니터까지 이동하는 데 소요되는 시간을 나타냅니다.샘플 분석이 진행되는 동안 시스템 압력과 pH는 비교적 일정하게 유지됩니다. 이 그림은 총 단백질의 인라인 검출을 수행한 순차적인 HI 컬럼 스카우팅 런의 크로마토그램을 보여줍니다. NGFP는 각각 280 nanometers와 397 nanometers에서의 빛 흡광도를 측정하여 달성됩니다.각 스카우팅 런의 상대적인 GFP 풍부도와 분리 정도를 근사치로 파악할 수 있습니다. 이 그림의 두 라인을 비교하면, fennel FF 스카우팅 런의 분획 10, 12, 14, 16, 18에 해당하는 배양 튜브를 주변광 또는 형광실내등 및 자외선 램프 하에서 전면과 상단 모두에서 관찰하여 특성 GFP 방출 스펙트럼을 확인하였으며, 분획 14에서 GFP가 명확하게 검출되었습니다. 두 UV 이미지 모두에서 왼쪽 UV 패널의 확산된 파란색은 UV 램프에서 방출되는 빛입니다.이러한 분석 후 데이터는 397 nm에서 용출액의 흡광도를 측정하여 GFP를 인라인으로 검출한 결과와 잘 일치하며, 이를 통해 14번 분획에 용출된 GFP의 주요 피크가 포함되어 있음을 확인할 수 있습니다. 이 절차 이후에, 정제 중인 단백질의 순도 및 기능적 활성과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 웨스턴 블롯팅, ELISA, 원자 힘 현미경 및 생화학적 재구성 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 방법의 여러 지점에서 이중 흐름 시스템을 수동으로 제어해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이에 대한 예로는 버퍼 재충전 및 시료 로딩, 기포 확인, 필요에 따른 검출 램프의 켜고 끄기 등이 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 최적의 HI 컬럼 및 충전제를 자동으로 탐색하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.인라인 및 포스터 분석을 통해 평가함으로써 연구자는 후속 스케일업 정제에 적합한 컬럼을 선택할 수 있으며, 이는 표적 단백질의 순도와 수율을 높이기 위해 다른 크로마토그래피 방법과 결합하여 사용할 수도 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

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단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정

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