쥐 강아지 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리(Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains)

뇌에 상주하는 대식세포인 미세아교세포는 세포 표면 인테그린인 CD11b를 발현합니다.

쥐 새끼 뇌에서 미세아교세포를 분리하려면 단백질 분해 효소인 파파인 및 데옥시리보뉴클레아제가 함유된 완충액이 포함된 해리 튜브에 대뇌 단편을 채취합니다.

튜브를 기계적 해리기에 놓습니다. 달리는 동안 해리제는 조직을 기계적으로 파괴합니다.

파파인은 조직의 세포외 기질을 소화하여 미세아교세포를 포함한 세포를 현탁액으로 방출합니다. 데옥시리보뉴클레아제는 현탁액의 유리 DNA를 분해하여 비효율적인 세포 분리를 방지합니다.

원심 분리기. 피펫팅으로 기계적 해리를 완료합니다. 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 옮겨 파편과 세포 덩어리를 제거하고 균질한 단일 세포 집단을 얻습니다.

항-CD11b 항체로 기능화된 초상자성 마이크로비드와 함께 배양합니다. 마이크로비드는 미세아교세포를 포함한 세포의 CD11b에 특이적으로 결합합니다.

배양 후, 원심분리기. 결합되지 않은 비드가 들어 있는 상층액을 제거합니다. 세포를 완충액에 재현탁합니다. 마그네틱 분리기에 놓인 컬럼에 로드합니다. 컬럼은 강자성 비드가 있는 매트릭스로 구성됩니다.

분리기 위에 놓으면 컬럼 내의 구체가 자기장을 증폭하여 컬럼 내에 마이크로비드에 결합된 CD11b+ 세포를 유지하고 다른 세포는 통과합니다.

분리기에서 제거하고 완충액을 사용하여 컬럼에서 CD11b+ 세포를 용리합니다. 현탁액을 원심분리하고 CD11b+ 세포를 미세아교세포 배지에 재현탁합니다.

된 세포는 추가 분석을 위한 준비가 되었습니다.

이 표에 따라 해리 혼합물을 준비합니다. 12개의 뇌 조각을 C-튜브로 옮겨 해리 튜브당 총 무게 1.2g이 됩니다. 그런 다음 가열이 있는 해리기 위에 C-튜브를 놓습니다. 해리기에서 최적화된 NTDK 프로그램을 시작합니다. 20초 동안 원심분리합니다. 세 번 피펫팅하여 기계적 해리를 완료합니다.

스트레이너가 부착된 4개의 15밀리리터 튜브로 세포를 옮깁니다. 칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS 10밀리리터로 스트레이너를 헹굽니다. 10분 동안 원심분리하고 10밀리리터 피펫으로 상청액을 제거합니다. 칼슘과 마그네슘이 포함된 HBSS 10밀리리터를 조심스럽게 첨가하고 펠릿을 재현탁합니다. 다시 원심분리하여 상청액을 제거합니다.

6밀리리터의 분류 완충액으로 펠릿을 재현탁합니다. 원심분리를 반복하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 200마이크로리터의 CD11b-마이크로비드 용액을 첨가하고 튜브를 섭씨 4도에서 15-20분 동안 배양합니다. 배양 후, 펠릿을 6밀리리터의 선별 완충액으로 재현탁합니다. 원심분리를 반복하고 8밀리리터의 분류 완충액으로 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 분리기의 POSSEL 프로그램에 따라 8개의 열을 준비합니다. 한 번에 1밀리리터의 세포 현탁액을 첨가하여 컬럼을 통해 세포를 통과시킵니다. 1밀리리터의 분류 완충액을 사용하여 멸균 용출 플레이트에서 CD11b 양성 세포를 용리합니다. 50밀리리터 튜브에 세포를 모으십시오.

릿을 원심분리하고 10밀리리터의 차가운 미세아교세포 배지로 재현탁합니다. CD11b 양성 세포를 계산합니다. 차가운 미세아교세포 배지에 세포를 재현탁하여 밀리리터당 650,000 내지 700,000 세포의 최종 농도를 얻습니다.