강한 TCR 신호에 대한 흉선세포 반응을 조절하는 키나아제 억제제 식별

멀티웰 플레이트에서 마우스 흉선 세포 세포로 시작합니다. 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 추가합니다. 웰의 하위 집합에 적절한 농도의 시험 키나아제 억제제를 첨가하십시오. 인큐베이트.

항체는 이중 양성 흉선세포의 세포 표면 CD3 및 CD28 수용체에 결합하여 활성화하여 T 세포 수용체, TCR의 하향 조절 및 세포질 단백질 키나아제의 활성화를 유발합니다.

이러한 단백질 키나아는 다운스트림 신호 전달 경로를 활성화하여 세포 표면 CD69 발현 및 세포질 카스파제-3 활성화를 증가시킵니다. 활성화된 카스파제-3는 필수 세포 단백질을 절단하여 흉선세포 세포사멸을 시작합니다.

키나아제 억제제로 처리된 세포에서 억제제는 세포질 키나아제를 차단하여 CD69 발현 및 카스파제-3 활성화를 조절합니다.

흉선세포의 TCR, CD4 및 CD8 보조 수용체 및 CD69 수용체에 결합하는 형광단 태그 항체 칵테일에서 피펫팅합니다. 흉선세포를 완충액으로 처리하여 고정하고 투과시킵니다.

세포질 카스파제-3에 결합하는 형광단 태그가 부착된 항-카스파제-3 항체와 함께 배양합니다. 유세포 분석을 사용하여 흉선세포를 분석합니다.

대조군 이중 양성 흉선세포는 형광 세포 표면 마커 CD4, CD8 및 CD69 및 세포내 카스파제-3를 발현하고 TCR 하향 조절을 나타냅니다. 대조적으로, 억제제 처리된 흉선세포는 더 낮은 수준의 형광 CD69 및 카스파제-3을 나타냅니다.

키나아제 억제제로 흉선세포 치료를 시작하려면 다중 채널 피펫을 사용하여 흉선세포 웰당 40마이크로리터를 소용량 플레이트에 추가합니다. 접시를 얼음 위에 올려 놓습니다. 그런 다음 키나아제 억제제, DMSO 및 덱사메타손의 1부와 전체 RPMI 배지의 4부를 96웰 플레이트에 피펫팅합니다.

마이크로몰 농도의 희석된 덱사메타손을 첨가하여 소용량 플레이트의 8웰을 처리되지 않은 대조군에게, 4개의 웰을 세포 사멸에 대한 덱사메타손 처리 양성 대조군에게, 희석된 DMSO의 0.5마이크로리터를 첨가하여 비히클 처리된 대조군에 4개의 웰을 지정합니다. 다음으로, 억제제 플레이트의 해당 웰에서 희석된 각 억제제 0.5마이크로리터를 96웰 플레이트에 추가합니다.

흉선세포의 자극을 시작하려면 먼저 항-CD3 및 CD28 비드가 균일하게 재현탁되었는지 확인합니다. 다음으로, 1밀리리터의 비드를 2밀리리터의 PBS 완충액으로 세척합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 올려 상청액에서 비드를 분리하고 용액을 흡인합니다. 그런 다음 비드를 전체 RPMI 배지 1밀리리터에 재현탁합니다.

각 억제제 처리 샘플, 4개의 DMSO 처리 샘플 및 8개의 처리되지 않은 샘플 중 4개에 비드 현탁액의 웰당 10마이크로리터를 추가합니다. 나머지 4개의 처리되지 않은 웰에 전체 RPMI 10마이크로리터를 추가합니다.

마이크로플레이트 오비탈 셰이커를 사용하여 플레이트를 부드럽게 교반합니다. 다음으로, 흉선 세포를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5% 환경에서 17-20시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.

자동 층류 플레이트 와셔를 먼저 150밀리리터의 에탄올-트윈 용액으로 프라이밍한 다음 1% 트윈-20이 보충된 탈이온수로, 마지막으로 FACS 세척 완충액을 프라이밍합니다. 배양이 끝나면 플레이트 와셔 시스템을 사용하여 9회 세척 주기를 사용하여 FACS 세척 완충액으로 플레이트를 세척합니다. 각 세척은 층류 흐름에 의해 55마이크로리터의 세척 완충액을 추가 및 제거하여 웰의 시약을 기하급수적으로 희석시킵니다.

표면 항원을 염색하려면 먼저 1단위 부피의 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8 및 항-CD69 항체를 100단위 부피의 FACS 세척 완충액에 희석합니다. 그런 다음 세포를 25마이크로리터의 염색 항체 혼합물에 재현탁합니다. 마이크로플레이트 오비탈 셰이커를 사용하여 플레이트를 부드럽게 교반한 다음 플레이트를 얼음 위에 30분 동안 그대로 둡니다.

세포를 고정하려면 먼저 앞서 설명한 대로 9회 세척 주기를 사용하여 55마이크로리터의 FACS 세척 완충액으로 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 50마이크로리터의 고정 및 투과화 완충액을 추가합니다. 잘 섞고 접시를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 제공된 10x 스톡 25밀리리터를 초순수 225밀리리터에 희석하여 1x 파마/세척 완충액을 준비합니다.

플레이트 와셔를 1x 완충액으로 프라이밍하고 앞에서 설명한 대로 9회 세척 주기를 사용하여 55마이크로리터의 1x 완충액으로 플레이트를 세척합니다. 항-카스파제-3 항체 1밀리리터와 1x 파마 및 세척액 2밀리리터를 혼합합니다. 고정 셀에 혼합물의 웰당 25마이크로리터를 추가합니다.

마이크로플레이트 오비탈 셰이커를 사용하여 플레이트를 부드럽게 교반합니다. 접시를 얼음 위에 한 시간 동안 그대로 두십시오. 배양이 끝나면 1x 파마 및 세척 완충액으로 세척 단계를 9회 반복합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 FACS 세척 완충액을 플레이트의 모든 웰에 추가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 용액을 혼합합니다.

마지막으로 혼합된 샘플을 마이크로타이터 튜브로 옮깁니다. FACS 세척 완충액을 튜브에 총 부피 200마이크로리터까지 채우고 유세포 분석을 진행합니다.