쥐 모델에서 항체에 반응하여 복막 대식세포의 생체 내 활성화(In vivo Activation of peritoneal macrophages in response to antibodies in a murine model)

복막강에 상주하는 복막 대식세포는 병원균을 삼키고 전염증성 및 항염증성 사이토카인을 분비하여 면역 반응을 조절합니다.

복막 대식세포의 생체 내 활성화를 연구하려면 마우스의 움직임을 최소화하도록 마우스를 구속하는 것부터 시작하십시오. 병원체 유래 항원과 정맥 면역글로불린인 지질다당류의 혼합물을 복강 내 주사합니다.

주사 후 지질다당류는 대식세포의 패턴 인식 수용체에 결합하여 면역 반응을 유발하고 IL-12를 포함한 전염증성 사이토카인을 방출합니다.

대조적으로, 면역글로불린은 대식세포 Fc 수용체와 상호 작용하여 IL-12 생성을 억제하고 IL-10을 포함한 항염증성 사이토카인의 방출을 촉진하여 면역 반응을 하향 조절합니다. 지질다당류와 면역글로불린에 의한 이러한 공동 자극은 복막 대식세포를 항염증성 대식세포로 활성화합니다.

안락사된 마우스를 고정하고 복강을 따라 세로 절개합니다. 복부 근육에서 피부를 집어넣습니다. 복막강에 완충액을 주입합니다. 복막강에서 세포를 제거하기 위해 교반합니다.

활성화된 대식세포 함유 복막액을 수집합니다.

토카인 생산을 가능하게 하기 위해 공동 자극 분자(면역글로불린 및 지질다당류)를 포함하는 배지에서 이러한 활성화된 대식세포를 배양합니다. 사용한 배지를 수집하고 효소 결합 면역흡착 분석을 사용하여 사이토카인 수준을 정량화합니다.

IL-12보다 IL-10 농도가 높으면 성공적인 복막 항염증 대식세포 활성화가 확인됩니다.

필요한 양의 정맥 면역글로불린과 LPS가 담긴 1밀리리터 주사기를 준비하고 26게이지 바늘을 부착합니다. 컨트롤의 경우 PBS와 LPS를 대신 사용하십시오.

한 손으로 뒷다리와 꼬리를 고정하면서 쥐의 목덜미를 잡습니다. 복부의 오른쪽 아래 사분면을 대상으로 바늘을 30도에서 40도 각도로 삽입하고 약 1.5cm 삽입합니다. 그런 다음 볼루스를 주입합니다. 한 시간 후, 마우스를 안락사시킨 후 복막 대식세포를 수확합니다.

멸균 후드에서 안락사된 쥐를 팔다리를 벌린 폼 보드에 고정하고 복부를 70% 에탄올로 살균합니다. 그런 다음 정중선을 따라 2mm의 얕은 절개를 하고 복부 피부를 잡아당깁니다. 복막벽에 구멍을 뚫지 마십시오.

다음으로, pH 7.4의 멸균 PBS가 포함된 5밀리리터 주사기를 완전히 로드하고 바늘의 경사가 위로 향하도록 양쪽에서 정중선을 향해 복막강 상단에 25 또는 27게이지 바늘을 사용하여 마우스를 주입합니다. 바늘을 뽑은 후 복막을 10초 동안 마사지하여 세포를 제거합니다.

이제 바늘을 다시 구멍에 삽입하고 약 3.75밀리리터의 세척액을 모으십시오. 세척액을 얼음 위의 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 주입, 마사지 및 세척액 수집을 세 번 더 반복하고 모든 수집액을 동일한 튜브에 모습니다.

최종 수집 중에 마우스의 반대쪽에서 세척액을 빼내는 것이 더 쉬울 수 있습니다. 다음으로, 세포를 회전시키고 500마이크로리터의 도금 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 생존 가능한 대식세포를 계산하고 밀리리터당 100만 개로 재현탁합니다. 이제 100마이크로리터의 현탁액을 96웰 평평한 바닥 플레이트의 웰에 도금합니다. 다음으로, 세포를 한 시간 동안 배양합니다.

복막 대식세포가 플레이트에 부착됩니다. 그런 다음 비부착 세포를 제거하고 200마이크로리터의 따뜻한 IMDM으로 각 웰을 두 번 헹굽니다. 각 세척 후 10초 동안 기다린 다음 플레이트를 천천히 기울여 헹굼 용액을 고입니다. 세척 후 100마이크로리터의 도금 배지를 다시 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.

ELISA의 경우 24시간 동안 자극 없이 세포를 계속 배양합니다. 그런 다음 사이토카인 분석을 위해 조절된 배지를 수집하고 정화합니다.